Огромную роль в функционировании человеческого организма играет такой защитный механизм как свертываемость крови. Если бы он отсутствовал, любое кровотечение приводило бы к смерти. Хорошая свертываемость кровяной субстанции – это замечательно, плохая или чересчур быстрая – можно говорить о наличии в организме патологий. Анализ-тест на свертываемость крови называется коагулограммой. Чтобы узнать о ее свойствах и пристально изучить показатели исследований, человеку придется обратиться в экспресс-лабораторию или взять направление у терапевта. В любом случае, без анализов и скрупулезного исследования здесь не обойтись.
Проводя лабораторное исследование, коагулограмму, оценивается способность крови к свертыванию. В конечном итоге у врача на руках будет расшифровка результатов, на основании которых он определит клиническую картину состояния организма и его отдельных функций. Система данного механизма достаточно сложная. Чтобы кровь свернулась на месте травмы кожного покрова, должно произойти слипание кровяных частиц. Образовавшийся тромб будет препятствовать дальнейшему вытеканию жидкости, а также предотвратит инфицирование.
Однако до полного свертывания дело не доходит. В процессе образования пробки, немалую роль играют две противоположные реакции. То есть в результате гемостаза активируются свертывающая и разжижающая функции. По завершению коагулограммы врач может составить график, на основании которого сделает выводы о работе такого процесса как гемостаз. Сдавать кровь на подобный анализ крайне важно, так как в ходе исследований могут выявиться серьезные патологии.
Норма свертываемости крови зависит от двух величин: коагуляции и антикоагуляции. Если правильный баланс нарушится, жидкость, текущая в организме, станет либо слишком густой или чересчур жидкой, что плохо в обоих случаях. На коагуляционный гемостаз влияет множество факторов. В их числе: функциональная полноценность тромбоцитов, система антикоагуляции, состояние сосудов и др. Врач может назначить гемостазиограмму по своему усмотрению, если для него будет важен такой показатель как норма свертываемости крови или при подозрении на определенный тип заболеваний:
Обычно данную процедуру совмещают с общим анализом крови. Определяется число эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина и других частиц. Если патология обнаружилась при базовом исследовании, врач назначает расширенный тест-анализ.
Сдавать кровь на коагуляционный гемостаз принято с утра, натощак. Это условие играет ключевую роль и определяет вероятность точных результатов. Чтобы показатели отражали реальную картину процессов, протекающих в организме, человек обязан придерживаться нескольких правил.
В зависимости от цели исследования, кровь могут брать как из пальца, так и из вены. Забор крови осуществляется по общим правилам. Если потребовался ее забор из вены, кровь должна центрифугироваться в течение двух часов. Далее, образовавшуюся плазму возьмут за основу, чтобы определить нужные показатели.
Полученная расшифровка предоставит врачу ключ к пониманию текущих процессов, которые вызывают подозрение. Норма полученных результатов после коагуляционного гемостаза – это усредненный показатель, впрочем, как и в любом другом анализе. При ее правильной интерпретации должны быть учтены все сопутствующие факторы: возможные травмы, обезвоживание организма, женские «дела», прием антикоагулянтов, гормональных контрацептивов и пр. В целом, норма времени кровотечения ограничивается значениями 3-10 минут. Расшифровка данных может сказать о том, что, если кровотечение увеличенное, возможны следующие патологии:
Свертывающая составляющая минимальна: ошибка при исследовании. В общем, она не имеет диагностического значения.
Ведущую роль на показатели крови оказывает исследование АЧТВ. Оно отражает плазменные свойства, интерпретирует коагуляционный гемостаз и считается самым точным анализом. Между тем, два проведенных исследования в разных лабораториях на предмет активированного частичного тромбопластинового времени могут отличаться показательными величинами, так как на получение исходных данных влияют применяемые реагенты, активаторы. В среднем, норма АЧТВ колеблется в границах 25,4-36,9 секунд.
Если расшифровка показывает завышенное значение – это может свидетельствовать о болезни Хагемана, фибренолизе, тяжелых печеночных, аутоиммунных патологиях, ДВС синдроме, гемофилии, инфузии реополиглюкина. Меньшее время АЧТВ – беременность, тромбоэмболия, ДВС синдром первой фазы, ошибка в исследовании.
В состав коагулограммы входит и другое исследование. Называется оно, свертываемость крови по Сухареву. Данный метод констатирует способность организма к самозащите, то есть, демонстрирует свертываемость крови в результате возможной травмы или аварии, но не несет в себе функций определения.
Свертываемость крови по Сухареву может показать, что какая- либо система в организме человека работает неправильно, например, эндокринная или нервная.
Данный тест является составным звеном коагулограммы и назначается врачом для получения общей картины гемостаза. В процессе взятия крови по Сухареву определяется временной интервал сворачивания между взятием жидкости и образованием фибринового тромба. Помимо вышеописанного способа практикуют еще метод Ли-Уайта. Вкупе, они предоставляют врачу динамику картины состояния сворачивания крови.
Поскольку апробирование по Сухареву играет большую роль в оценке свертывания кровяной жидкости, к сдаче анализа нужно подходить со всей ответственностью. От этого зависит, какой будет норма, то есть, не окажутся ли результаты искаженными.
Поскольку забор крови проводится из пальца, натощак, следует:
Весь процесс протекает быстро и безболезненно. Взятая кровь помещается в аппарат Панченкова для проведения исследований. У здорового человека норма свертывания крови должна быть: начало — от 30 секунд до 2-х минут. Окончание: 3-5 минут. Показатели могут варьироваться по причине текущих заболеваний или тогда, когда пациент принимает различные антикоагулянты.
Если анализ на свертываемость крови по Сухареву не выявил отклонений, человек скорей всего здоров. Об этом будет свидетельствовать норма коагуляции, которая определяет ведущую роль, то есть ее отсутствие, укажет на наличие каких-либо отклонений . Так, уменьшенное значение свертываемости крови может быть признаком тромбоэмболии, а увеличенное время свертываемости – прием препаратов, способных разжижать кровяной поток или нарушение функций протромбинов. Ускоренный процесс часто связан с менструальными кровотечениями, сепсисом, приеме противозачаточных таблеток (у женщин), при травмах, ожогах, васкулите и других заболеваниях.
Коагулограмма (син.: гемостазиограмма) представляет собой набор показателей крови, характеризующих ее способность к свертыванию. Свертываемость крови — одна из многих защитных функций, поддерживающих нормальную жизнедеятельность организма.
Оценивать коагулограмму, которая бывает базовой и расширенной, следует совместно с общим анализом крови, включающим определение числа тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобина, гематокрита. Все показатели коагулограммы являются ориентировочными. Если выявлена патология при базовом исследовании, проводят его расширенный вариант, который может включать оценку факторов свертываемости крови.
Ускорение свертываемости, так называемая гиперкоагуляция, ведет к повышенному тромбообразованию, что чревато развитием тромбозов и тромбэмболий. Снижение же свертываемости, или гипокоагуляция, несет опасность развития неконтролируемых кровотечений.
Как проходит процедура?
Забор крови осуществляется из локтевой вены натощак утром.
Показания для назначения анализа крови на свертываемость
Время кровотечения — основной показатель состояния системы гемостаза, ее сосудисто-тромбоцитарного звена. Для исследования скарификатором прокалывают мочку уха и фиксируют время, через которое кровь остановится. Оценивается только удлинение показателя. Тест не должен применяться для предоперационного планового скрининга.
| Норма времени кровотечения | |
| 3-10 мин. |
Интерпретация результатов
Удлинение времени кровотечения:
Укорочение времени кровотечения:
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) — это показатель эффективности остановки кровотечения плазменными факторами, характеризует коагуляционный (плазменный) гемостаз и является самым чувствительный и точным показателем гемостазиограммы. Значение АЧТВ, в первую очередь, зависит от используемых врачом реагентов-активаторов, и в разных лабораториях показатель может варьировать.
| Норма АЧТВ | |
| 25,4-36,9 сек. |
Интерпретация результатов
Удлинение АЧТВ:
Укорочение АЧТВ:
Протромбиновое время (ПТВ) — это время формирования тромбинового сгустка, если добавить в плазму кальций и тромбопластин, характеризует коагуляционный (плазменный) гемостаз. Показатель отражает 1 и 2 фазу плазменного свертывания и активность работы II, V, VII и X факторов. Тест используется для оценки внешнего механизма свертывания крови. Терапия антикоагулянтами считается действенной, если ПТВ увеличивается хотя бы в 1,5-2 раза.
| Норма протромбинового времени (ПТВ) | |
| дети | взрослые |
14-19 сек; 13-17 сек; дети младшего возраста: 13-16 сек; дети старшего возраста: 12-16 сек; |
11-15 сек. |
Интерпретация результатов
Укорочение ПТВ:
Удлинение ПТВ:
МНО (Международное нормализованное отношение), или протромбиновый коэффициент — это отношение ПТВ пациента к ПТВ нормальной плазмы в степени международного индекса чувствительности. Данный показатель является математической корректирующей величиной, при помощи которой производится стандартизация ПТВ, дабы сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях. Главная цель определения МНО — контроль приема больными непрямых антикоагулянтов. В норме МНО приближается к 1. Терапевтический диапазон МНО 2-3 на фоне терапии непрямыми антикоагулянтами обеспечивает профилактику тромбоза без увеличения риска кровотечения.
| Норма МНО | |
| 0,8-1,15 |
Интерпретация результатов
Увеличение ПТВ времени и МНО:
Снижение ПТВ и МНО:
Тромбиновое время (ТВ) — это третий по значимости базисный коагуляционный тест, характеризующий конечный этап процесса свертывания — превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. Определяется всегда вместе с АЧТВ и ПТВ для контроля фибринолитической и гепаринотерапии, диагностики врожденных патологий фибриногена. Определение ТВ используют в целях выявления дисфибриногенемий и оценки антикоагулянтной активности крови.
| Норма тромбинового времени | |
| 18-24 с |
Интерпретация результатов
Удлинение ТВ:
Укорочение ТВ:
Фибриноген — по международной номенклатуре фактор I (первый) свертывающей системы плазмы. Количественное определение фибриногена по методу Клаусса является базисным тестом исследования гемостаза. Фибриноген относится к белкам острой фазы, его концентра-ция повышается в плазме при инфекциях, травмах, стрессах. Рост концентрации фибриногена в плазме даже в пределах референсных значений коррелирует с увеличением риска осложне-ний сердечно-сосудистых заболеваний.
Интерпретация результатов
Увеличение содержания:
Уменьшение содержания:
Антитромбин III (АТ III) — это физиологический антикоагулянт, ингибитор плазменных факторов свертывания крови, плазменный кофактор гепарина. Оказывает основное угнетающее (антикоагуляционное) действие на процессы свертывания крови. Тест применяют для мониторинга лечения гепарином.
| Норма антитромбин III (АТ III) | |
| 75-125% |
Интерпретация результатов
Повышение уровня АТ III:
Снижение уровня АТ III:
D-димеры — специфические продукты деградации фибрина, входящие в состав тромба. Относится к тестам активации свертывания крови (прокоагуляции). Концентрация D-димеров в сыворотке пропорциональна активности фибринолиза и количеству лизируемого фибрина. Данный тест позволяет судить об интенсивности процессов образования и разрушения фибриновых сгустков. Повышенный уровень D-димера выявляется при множестве состояний, связанных с активацией коагуляции.
Интерпретация результатов
Повышение уровня показателя:
Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) являются промежуточными продуктами распада фибринового сгустка вследствие фибринолиза, относится к тестам активации свертывания крови (паракоагуляции). РФМК очень быстро выводится из плазмы крови, поэтому его очень тяжело определить. Тест РФМК используется, главным образом, для ранней диагностики ДВС-синдрома.
Интерпретация результатов
Повышение уровня показателя:
| Параметр | Норма |
| Время кровотечения | 3-10 мин. |
| Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) | 25,4-36,9 сек. |
| Протромбиновое время (ПТВ) | новорожденные недоношенные дети:
14-19 сек; новорожденные доношенные дети: 13-17 сек; дети младшего возраста: 13-16 сек; дети старшего возраста: 12-16 сек; взрослые: 11-15 сек. |
| Международное нормализованное отношение (протромбиновый коэффициент) | 0,8-1,15 |
| Тромбиновое время (ТВ) | 18-24 с |
| Фибриноген | 2,75-3,65 г/л |
| Антитромбин III (АТ III) | взрослые — 75-125% |
| D-димеры | 33,5-727,5 нг/мл |
| Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) | по ортофенантролиновому тесту — до 4,0 мг% |
К основным тестом свертывания крови относят определение времени ее свертывания (по Ли-Уайту), время рекальцификации плазмы, показатель АЧТВ, время ретракции кровяного сгустка и некоторые другие параметры.
Время свертывания крови по Ли-Уайту определяют как время которое проходит от момента забора крови из сосуда до образования кровяного сгустка.
Этот показатель является неспецифичным и характеризует свертывающую систему крови в целом.
Для проведения анализа один миллилитр крови набирается в пробирку (обычную или силиконовую) и выдерживается при температуре 37 градусов. В норме, в несиликоновой пробирке, кровь сворачивается за 5-7 минут, а в силиконовой – за 15-25.
Удлинение времени свертывания крови возможно в таких случаях:
Если кровь не сворачивается вообще, это, чаще всего, является признаком резкого дефицита фибриногена.
Уменьшение времени свертываемости крови встречается довольно редко.
Иногда определяют также индекс контактной активации. Этот показатель характеризует соотношения времени свертывания в силиконовой и несиликоновой пробирках и в норме колеблется от 1,7 до 3,0.
Увеличение индекса контактной активации возможно при нарушении функций печени, избыточном количестве антикоагулянтов, нарушении определенных звеньев гемостаза.
Под временем рекальцификации плазмы подразумевается промежуток времени, который необходим для образования сгустка после добавления солей кальция. Нормальным показателем считается диапазон в одну-две минуты.
Исследуется также активированное время рекальцификации (каолиновое время или показатель АВР). От предыдущего этот параметр отличается методикой проведения анализа. Норма АВР – 50-70сек.
Удлинение времени рекальцификации возможно при:
Уменьшение времени рекальцификации – признак повышенной активности свертывающей системы.
Этот показатель также носит названия АЧТВ, АПТВ или каолин-кефалинового времени. Данный тест используется для определения функции плазменных факторов свертывания крови.
В норме АЧТВ составляет 35-45 секунд.
Увеличение АЧТВ более 45 секунд может наблюдаться при:
Уменьшение АЧТВ (менее 35 секунд) может быть признаком неправильной техники забора крови для анализа либо повышенной свертываемости крови.
Этот показатель используется для количественной оценки плотности образованного при свертывании крови сгустка.
Суть метода состоит в том, что крови дают свернуться, а затем оценивают соотношение между жидкой частью после образования тромба и исходным объемом взятой для анализа крови.
При определении стандартным методом ретракция кровяного сгустка находится в пределах 45-65%.
Уменьшение показателя ретракции возможно в случае:
Повышенная ретракция сгустка встречается при анемиях и увеличении количества фибриногена в крови.
В некоторых лабораториях активность свертывающей системы крови определяется не по стандартным тестам коагулограммы, а с помощью специальных приборов (коагулографа или тромбоэластографа) которые позволяют получить графическое изображение процессов свертывания крови.
Анализ такого изображения (при соблюдении должной техники записи) позволяет наиболее точно оценить гемостаз.
При помощи тромбоэластографии определяют длительность трех основных фаз свертывания крови и некоторые специфические показатели.
Коагулография – высокоспецифичный метод при помощи которого можно определить продолжительность отдельных процессов свертывания.
Аутокоагулограммой или аутокоагуляционным тестом называется относительно редко используемая методика исследования свертывающей системы.
Для проведения анализа в особым образом обработанную кровь с равными промежутками в течение часа добавляют специфический реагент, каждый раз определяя свертываемость крови. По полученным данным вычерчивается график. Этот график отображает взаимосвязь и равновесие между свертывающей и противосвертывающей системы крови.
При использовании сокращенной методики тестирование проводится в течение десяти минут.
Чаще всего метод построения и анализа аутокоагулограммы применяют при длительном использовании гепарина или для диагностики гемофилии.
Время свертывания цельной крови по Ли-УайтуХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Время свертывания крови - время образования сгустка свежевзятой нестабилизированной венозной крови в стеклянной пробирке.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Специальной подготовки пациента не требуется. Во избежание погрешностей в результатах теста при взятии венозной крови необходимо избегать массажа предплечья, немедленно расслабить жгут после появления крови и выпустить первые ее капли, содержащие фрагменты поврежденных тканей, на ватный/марлевый тампон.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
После обработки спиртом и высушивания области локтевого сгиба в локтевую вену вводят сухую широкую иглу без шприца.
В сухую стеклянную несиликонированную пробирку набирают 1 мл крови, запуская секундомер сразу при ее попадании. Исследование проводят при температуре 20-25 °С. Через 2 мин после взятия крови, а затем каждые 30 с пробирку осторожно наклоняют под углом 45-60° и определяют, растекается ли кровь по стенкам. Секундомер останавливают по завершении образования сгустка (кровь не переливается при наклоне пробирки).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Время свертывания цельной крови при комнатной температуре - 6-11 мин. В связи со значительным влиянием интерферирующих факторов (температуры, состояния стенок пробирки и иглы, частоты и амплитуды наклона пробирки, объема крови и особенностей процедуры ее взятия) разброс результатов теста даже при точном соблюдении условий довольно велик. Тест ориентировочный, для него не существует калибровочных и контрольных материалов.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Возрастание времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах: выраженном дефиците фибриногена и плазменных факторов внутреннего пути гемостаза, действии антикоагулянтов, значительной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови и др.
Понижение (менее 4-6 мин) клинически малоинформативно; можно предположить гиперактивацию плазменных факторов или нарушение реологических свойств крови, но чаще укорочение время свертывания крови связано с нарушением техники взятия крови (травматичностью процедуры) или тромбоцитозом. Для дифференцировки требуется проведение скрининговых (оценочных) коагулологических тестов.
Время свертывания крови активированное
Действие каолина при выполнении теста считается аналогичным появлению в кровотоке контактной поверхности - коллагена субэндотелия, искусственных клапанов сердца, протезированных сосудов, магистралей аппаратов для экстра-корпоральных методов лечения и т. д. При этом происходят последовательная каскадная активация плазменных белковых факторов внутреннего пути гемостаза, образование тромбина и формирование фибринового сгустка.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Основная задача при взятии крови - минимальное травмирование тканей, чтобы не спровоцировать высвобождение тканевого фактора.
При взятии капил¬лярной крови желательно пользоваться стандартным ланцетом с круглой иглой, минимально травмирующей ткани при проколе. Во избежание искажения результатов нельзя выдавливать кровь из пальца.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест выполняют на специальных коагулометрах для цельной крови с одноразовыми картриджами, содержащими стандартное количество активатора контактной фазы - каолина. В некоторых картриджах, кроме каолина, содержится инактиватор гепарина, исключающий его влияние на результаты теста. Кровь собирают в картридж прибора с помощью специальной пипетки или капилляра и быстро перемешивают; дальнейшая процедура определения идет автоматически. Момент образования сгустка определяется по изменению сопротивления между электродами, контактирующими с кровью, и образующимся сгустком (электро-метрическое определение) или по затруднению вращения пластикового флажка в кювете (механический коагулометр).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
В большинстве приборов результат колеблется в пределах 80-120 с, зависит от серии картриджей, условий их хранения и использования, количества и свойств каолина, интенсивности и полноты перемешивания крови с каолином, типа регистратора, температуры. В связи со стандартизацией контактной активации свертывания разброс результатов существенно меньший по сравнению с тестом времени свертывания крови.
Для теста нет калибровочных и контрольных материалов (контрольной цельной крови). О качестве анализа можно приближенно судить по результатам исследования венозной или капиллярной крови нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение тестом времени свертывания крови свидетельствует о гипокоагуляционных сдвигах - дефиците или инактивации плазменных факторов, циркуляции антикоагулянтов, выраженной гемодилюции, гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, а также возможно при тромбоцитопении. Уменьшение тестом времени свертывания крови активированного может наблюдаться при гиперактивации плазменных факторов, но оно не является основанием для окончательного вывода о состоянии гиперкоагуляции и принятия терапевтических мер (необходимы дополнительные исследования).
В основном определение времени свертывания крови активированного проводят для контроля и регулирования уровня гепаринизации пациента во время работы искусственных органов (аппаратов искусственного кровообращения, искусственной почки, печени, гемосорбции), расчета нейтрализующей дозы протамина сульфата и оценки полноты нейтрализации гепарина. Достоинством метода является возможность исследования непосредственно у постели больного или в операционной (poin of саге - диагностика по месту лечения), а также относительная быстрота выявления больных, резистентных к гепарину, когда для достижения оптимального эффекта приходится вводить повышенные дозы препарата.
Каолиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при 37 °С после стандартной активации контактной фазы каолином (цеолитом) и рекальцификации (восстановления физиологической концентрации ионов Са2+, ранее связанных цитратом при взятии крови). Матрицей для сборки ферментных комплексов коагуляции служат оставшиеся в плазме после центрифугирования тромбоциты паци-ента и фрагменты фосфолипидных мембран, но их недостаточно для полноценного протекания коагуляционных реакций. Именно поэтому тест, помимо коагуляционных факторов, чувствителен к количеству фосфолипидных образований в плазме и их свойствам, а также к присутствию антифосфолипидных антител.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза; накладывают жгут не более чем на 1 мин, используют одноразовые острые иглы достаточного диаметра, расслабляют жгут после появления крови из иглы и выпускают первые капли на ватный тампон. Кровь берут в пробирку с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1 и немедленно перемешивают. Более предпочтительны вакуумные системы для взятия крови, содержащие цитрат; их содержимое перемешивают четырехкратным переворачиванием. Пробирки с цитратной кровью центрифугируют при 1500-2000 g в течение 15 мин и осторожно отбирают супернатант - бедную тромбоцитами плазму. Хранить бедную тромбоцитами плазму до исследования лучше в пластиковых пробирках и непосредственно перед анализом перемешать.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К бедной тромбоцитами плазме добавляют суспензию каолина, прогревают при 37 °С, вносят раствор кальция хлорида и запускают секундомер (или начинают измерение на коагулометре). Определяют время образования фибринового сгустка на коагулометре (предпочтительно) или периодически наклоняя пробирку в водяной бане. Рекомендуют усреднять показатели двух определений одной и той же плазмы.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Результат колеблется в пределах 65-90 с.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты теста сильно влияют условия центрифугирования крови (от них зависит остаточное количество тромбоцитов), а также количество и свойства добавляемого каолина.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Значения каолинового времени свыше 90 с могут свидетельствовать о гипокоагуляции - дефиците плазменных факторов (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), гипокоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, выраженной гемодилюции, циркуляции антикоагулянтов (гепарина и др.) или наличии ингибиторов плазменных факторов и антифосфолипидных антител. Каолиновое время менее 65 с часто бывает связано с нарушением условий центрифугирования или взмучиванием осадка при отборе супернатанта. Кроме того, аналогичные сдвиги возможны при гиперактивации плазменных факторов (в гиперкоагуляционной фазе диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови крови), недостатке естественных антикоагулянтов и др.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест каолинового времени, выполняемый на бедной тромбоцитами плазме, сохранил свое значение лишь при определении волчаночного антикоагулянта; в других случаях желательно выполнение более информативного теста активированного частичного тромбопластинового времени, дающего меньший разброс результатов.
Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время свертывания бедной тромбоцитами цитратной плазмы при физиологической температуре (37 °С), в условиях стандартной активации контактной фазы, в присутствии фосфолипидов и при добавлении ионов Са2. Заменителем тромбоцитарной фосфолипидной матрицы для сборки коагуляционных ферментных комплексов служат фосфолипиды мозга, эритроцитов или сои, заменителем активационной контактной поверхности - каолин или эллаговая
кислота. Благодаря отсутствию тромбоцитов в плазме и добавлению их заменителя - парциального тромбопластина - на результаты теста практически не влияют тромбоцитарные факторы. Возможно определение активированного частичного тромбопластинового времени на портативных коагулометрах со специализированными картриджами. Иногда тест обозначают как активированное парциальное тромбопластиновое время активированного частичного тромбопластинового времени, что является аналогом активированного частичного тромбопластинового времени.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза (с добавлением цитрата) и получения бедной тромбоцитами плазмы. Параметры активированного частичного тромбопластинового времени стабильны до 4 ч при комнатной температуре; при лечении гепарином исследование необходимо провести в течение 1 ч после взятия материала. Возможно хранение замороженной бедной тромбоцитами плазмы до 10-20 дней, но допустимо лишь однократное размораживание.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 20-45 с. Результаты теста активированного частичного тромбопластинового времени зависят от точности соотношения кровь/цитрат, вида и свойств фосфолипидного компонента и каолина (или эллаговой кислоты), температуры, а также от способа регистрации результатов, типа и чувствительности прибора, вида и активности реагентов, а также от типа оборудования. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои, локальные значения нормы.
Для снижения влияния интерферирующих факторов возможна оценка результата в виде индекса активированного частичного тромбопластинового времени, диапазон нормальных значений которого составляет 0,8-1,2:
Индекс АЧТВ = АЧТВ пациента / АЧТВ контрольной нормальной плазмы.
Возможные варианты контрольной плазмы для расчета индекса активированного частичного тромбопластинового времени:
Смесь плазм не менее чем от 10 здоровых людей, полученных в тех же условиях, что и плазма пациента (это проблематично для небольших лабораторий). Кроме того, обычно не бывает уверенности в том, что эти люди здоровы.
Лиофилизированная референтная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), которую следует разводить за 30 мин до исследования. Лучше, чтобы плазма была заранее протестирована на данном виде прибора и рекомендована производителем оборудования в качестве референтной.
Оптимальный вариант - перекалибровка конкретного типа прибора для определенных видов реагентов и плазм, используемых в лаборатории (так поступают крупные производители лабораторного оборудования). В этом случае для расчетов индекса активированного частичного тромбопластинового времени можно использовать результат измерения аттестованной контрольной плазмы нормального уровня.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста активированного частичного тромбопластинового времени отсутствует, поскольку при определении используют различные реагенты и приборы разной чувствительности. В коагуляционных исследованиях желательно соблюдать рекомендации производителя оборудования для выбора контрольных материалов. Для контроля качества чаще используют свежеразведенную референтную нормальную пулированную плазму, срок годности - 2-4 ч после разведения лиофилизированного препарата) с аттестованным значением активированного частичного тромбопластинового времени. Смешанная бедная тромбоцитами плазма от нескольких здоровых людей (годна в течение 4-6 ч с момента получения) может быть использована для оценки сходимости и воспроизводимости или как вторичный стандарт. Разброс результатов при исследовании одного образца плазмы и использовании реактивов одной серии не дол¬жен превышать 10%.
Нельзя исследовать плазму, имеющую сгустки или следы гемолиза, поскольку из-за активации гемостаза активированного частичного тромбопластинового времени такой пробы может быть уменьшено. При наличии в исследуемой плазме гепарина активированного частичного тромбопластинового времени может значительно удлиняться - до 300 с и более, вплоть до полного несвертывания. Антикоагулянт может попасть в пробу при получении крови из катетера (что крайне нежелательно) или при системном использовании гепарина. В том случае, когда избежать попадания гепарина в пробу невозможно, для исключения эффекта антикоагулянта используют АЧТВ-реагент с инактиватором гепарина либо плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют, сливая ее с осадка.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение активированного частичного тромбопластинового времени может свидетельствовать:
о врожденном или приобретенном снижении количества/активности факторов внутреннего пути гемостаза (XII, XI, IX, VIII, X, V, II, фибриногена), реже - фактора фон Виллебранда. Снижение факторов IX, X и II возможно, в частности, при лечении непрямыми антикоагулянтами;
об избытке в пробе цитрата - абсолютном (слишком большое количество добавленного цитрата) или относительном (неполное заполнение кровью пробирки со стандартным количеством цитрата);
о наличии в пробе гепарина (при введении пациенту или попадании из катетера) или гирудина;
о наличии в пробе некоторых инфузионных препаратов (декстранов);
о наличии в пробе продуктов деградации фибрина/фибриногена, патологических ингибиторов плазменных факторов или антикоагулянтов волчаночного типа.
Уменьшение активированного частичного тромбопластинового времени клинического значения не имеет, поскольку часто бывает связано с погрешностями взятия и обработки крови. Диагностика гиперкоагуляционных состояний должна основываться на определении маркеров активации гемостаза и оценке конкретной клинической ситуации.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест активированного частичного тромбопластинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы, выявляющий сдвиги внутреннего пути активации свертывания (клиническое значение имеет удлинение активированного частичного тромбопластинового времени). Определение активированного частичного тромбопластинового времени проводят для первичного выявления гипокоагуляционных сдвигов, диагностики гемофилии и мониторинга состояния больных с нарушениями свертывания крови, при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, для контроля гепаринотерапии, выявления патологических ингибиторов. При диагностике антифосфолипидного синдрома для определения волчаночного антикоагулянта используют так называемый люпус-чувствительный АЧТВ-реагент со сниженным содержанием фосфолипидов.
Коррекционные пробы по тесту активированного частичного тромбопластинового времени
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси исследуемой плазмы с нормальной донорской плазмой либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам свертывания. Пробы позволяют разграничить причину удлинения активированного частичного тромбопластинового времени - дефицит/дисфункцию факторов свертывания (с определением конкретного недостающего фактора) или наличие ингибиторов свертывания.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Перед выполнением проб необходимо определение активированного частичного тромбопластинового времени исследуемой плазмы; коррекцию проводят лишь при его удлинении. Отдельную порцию тестируемой плазмы смешивают в соотношении по объему 1:1 со свежей нормальной пулированной донорской плазмой или свежеразведенной РНП-плазмой (либо плазмой, дефицитной по отдельным факторам) и повторяют определение активированного частичного тромбопластинового времени.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты проб может влиять присутствие в тестируемых образцах прямых антикоагулянтов (гепарина и гирудина).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
При наличии в исследуемой пробе ингибиторов свертывания (волчаночного антикоагулянта, ингибиторов факторов VIII и IX) добавка нормальной плазмы не приводит к нормализации активированного частичного тромбопластинового времени. При дефиците факторов в исследуемой плазме недостающие вещества вносят в составе добавки нормальной плазмы, после чего удлиненное активированное частичное тромбопластиновое время становится нормальным. Добавляя субстратную плазму, дефицитную по отдельным факторам, можно определить конкретный недостающий фактор; при добавке плазмы, дефицитной именно по этому фактору, активированное частичное тромбопластиновое время не приходит к норме, в то время как дефицитные плазмы по другим факторам вызывают нормализацию параметра.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
С помощью коррекционных проб по тесту активированного частичного тромбопластинового времени выявляют дефицит факторов внутреннего пути гемостаза и/или наличие их ингибиторов (диагностика врожденной и ингибиторной гемофилии, антифосфолипидного синдрома).
Протромбиновое время
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Исследование протромбинового времени представляет важнейший скрининговый тест для оценки системы свертывания крови. Определяют время образования фибринового сгустка в бедной тромбоцитами цитратной плазме при активации внешнего пути гемостаза тканевым тромбопластином, содержащим тканевый фактор и фосфолипиды, в присутствии ионов Са2+ при 37 °С. Источником тромбопластина могут быть эритроциты, ткани мозга или другие ткани; может быть использован и рекомбинантный тромбопластин. Возможно определение протромбинового времени цельной крови на портативных коагулометрах со специальными картриджами.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза. Оптимальным является исследование венозной крови. Капиллярная кровь менее пригодна для определения протромбинового времени, поскольку содержит непредсказуемое количество тканевого фактора, попадающего в нее при проколе пальца, что создает определенные проблемы (в частности, в педиатрии). Капиллярную кровь имеет смысл исследовать при наличии специальных портативных коагулометров, в которых время образования сгустка выражается в пересчете на эквивалент венозной крови и используются картриджи с реагентами, сводящими к минимуму влияние «собственного» тканевого фактора. Кровь из пальца берут непосредственно перед анализом, избегая давления на мягкие ткани; первую каплю удаляют ватным тампоном. Взятую кровь смешивают с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, капилляр для взятия предварительно промывают тем же раствором цитрата.
Результаты теста протромбинового времени остаются стабильными до 24-48 ч при хранении венозной крови с цитратом при комнатной температуре в закрытых первичных вакуумных пробирках. При работе с открытыми пробирками требуется отделить плазму от клеток в течение 60 мин и провести определение протромбинового времени в течение 2-4 ч после взятия крови. Полученную плазму до исследования хранят при комнатной температуре; охлаждение до 4 °С более чем на 24 ч может привести к Холодовой активации фактора VII и уменьшению протромбинового времени.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследуемую плазму прогревают до 37 °С, вносят тромбопластиновый реагент с кальция хлоридом и определяют время образования фибринового сгустка (на коагулометре или вручную). При определении протромбинового времени капиллярной крови используют тот же принцип, но применяют реагенты с иной концентрацией действующих веществ, а измерение проводят вручную или на коагулометре с механическим принципом регистрации (желательно в параллельных пробах с вычислением среднего результата).
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА ПРОТРОМБИНОВОГО ВРЕМЕНИ Протромбиновая активность плазмы по Квику
Тест основан на расчетах по калибровочному графику, отражающему зависимость активности протромбинового комплекса (т. е. значения протромбинового времени) от степени разведения нормальной плазмы, выраженной в процентах. Для построения калибровочного графика определяют протромбиновое время неразведенной свежей нормальной пулированной плазмы (100%) и ее 50, 25 и 12,5% разведений. Некоторые исследователи считают нецелесообразным разведение 12,5% из-за снижения содержания фибриногена. Результаты откладывают на координатной сетке и соединяют линией.
При тестировании плазмы пациента измеряют значение протромбинового времени и по калибровочному графику определяют процент протромбина по Квику, отражающий активность факторов протромбинового комплекса в процентах к плазме здоровых людей. Современные коагулометры автоматически рассчитывают этот показатель исходя из результатов определения протромбинового времени в плазме пациента и разведениях контрольной плазмы.
Протромбиновая активность плазмы по Оврену
Кроме теста Квика, при оценке действия непрямых антикоагулянтов возможно исследование плазмы по Оврену. В нем используют реагенты с добавлением адсорбированной бычьей плазмы, содержащей фактор V и фибриноген, что позволяет исключить влияние этих двух компонентов на результаты теста и исследовать активность других факторов протромбинового комплекса (VII, X и II). При этом образцы исследуемых плазм остаются стабильными более длительное время, так как метод оказывается не зависимым от активности термолабильного фактора V.
Расчетные показатели на основе протромбинового времени
Для снижения влияния интерферирующих факторов рекомендуют одновременно определять протромбиновое время исследуемой пробы и референтной нормальной пулированной плазмы, а оценку результата проводить в виде отношений протромбинового времени. Современные коагулометры и анализаторы гемостаза автоматически рассчитывают показатели исходя из результатов определения протромбинового времени в пробе пациента и нормальной плазме.
Протромбиновое отношение: ПО = ПВ пациента / ПВ нормальной плазмы.
Показатель протромбинового отношения имеет прямую логическую связь с изменениями протромбинового времени плазмы пациента (удлинение протромбинового времени влечет за собой увеличение протромбинового отношения). Вместе с тем на результаты определения протромбинового отношения влияет чувствительность конкретного используемого тромбопластина к недостатку факторов внешнего пути (VII, X, V и II), что может привести к несопоставимости данных, полученных с разными партиями реагента.
Прием антикоагулянтов непрямого действия приводит к удлинению протромбинового времени, однако измеренная степень его удлинения существенно колеблется в зависимости от используемого тромбопластинового реагента. В связи с этим Комитет по стандартизации в гематологии ВОЗ в 1983 г. принял стандартизированный показатель - международное нормализованное отношение, который рассчитывают при контроле лечения непрямыми антикоагулянтами (когда недопустимы колебания показателей протромбинового теста в зависимости от применяемых реагентов). Международное номализованное отношение вычисляют исходя из протромбинового отношения и международного индекса чувствительности используемого тромбопластина к нехватке факторов протромбинового комплекса: МНО = ПОмич.
Международный индекс чувствительности для каждой серии реагента обозначается на его упаковке и обычно составляет от 1,0 до 1,6 (более низкое значение предпочтительнее). При использовании тромбопластина, не аттестованного по международному индексу чувствительности, расчет международного нормализованного отношения невозможен; в этом случае определяют протромбиновую активность по Квику.
При определении междунарожного нормализованного отношения в пробе капиллярной крови вследствие влияния форменных элементов крови результат получается менее надежным по сравнению с анализом плазмы, поэтому без использования специальных портативных коагулометров выполнять это исследование не рекомендуют.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Протромбированное время=10-20 с (зависит от типа реагента и условий определения). Доля протромбина по Квику составляет 60-130% (зависит от препарата тромбопластина); некоторые производители указывают только нижнюю границу нормы (например, более 70%), подчеркивая, что уменьшение протромбинового времени и повышение процента протромбина клинического значения не имеют.
Протромбиновое отношение=0,85~1,2. Референтные значения для междурародного нормализованного отношения указывать некорректно, так как этот показатель должен исследоваться у больных, принимающих антикоагулянты непрямого действия; терапевтический интервал международного нормализованного отношения выбирают в зависимости от показаний к назначению препаратов.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Результаты теста протромбинового времени зависят от объема взятой крови по отношению к количеству цитрата в пробирке, активности препарата тромбопластина и его чувствительности к недостатку факторов VII, X, V и II, а также от температуры. При наличии гепарина в исследуемом образце протромбиновое время может значительно удлиняться - до 40 с и более; для исключения такого влияния плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина и центрифугируют.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
В тесте Квика калибровочный график строят для каждой новой серии исследований (на одни сутки) и каждой новой серии тромбопластинового реагента. Для обеспечения корректности результатов во всех случаях используют только свежую пулированную плазму от здоровых доноров или свежеразведенную нормальную плазму, для контроля качества - РНП-плазму. Стандартный контрольный материал ВОЗ для теста протромбинового времени отсутствует, поскольку используют различные реагенты и приборы разной чувствительности, однако производители, как правило, предлагают контрольные плазмы для конкретных условий (реагенты/оборудование). Для оценки воспроизводимости и сходимости может быть использована свежая смешанная плазма от нескольких здоровых доноров (не менее 10) или свежеразведенная лиофилизированная нормальная пулированная плазма (РНП-плазма), срок их годности - 2-4 ч с момента получения или 2 ч после разведения лиофилизированного препарата соответственно. Для повышения точности рекомендуют проводить определение на коагулометре; при исследовании параллельных проб разброс результатов протромбинового времени не должен превышать 1 с.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Увеличение протромбинового времени или снижение процента протромбина по Квику может быть связано с врожденным (редко) или приобретенным снижением активности либо дефицитом факторов внешнего пути активации свертывания или (реже) наличием их ингибиторов. Это возможно при заболеваниях печени, коагулопатиях потребления и потерях факторов, дефиците витамина К, приеме некоторых лекарственных препаратов (особенно антагонистов витамина К). При достаточном содержании факторов удлинение протромбинового времени возможно при снижении содержания фибриногена менее 1,5-1,0 г/л, а также под действием прямых антикоагулянтов, но в последнем случае тест протромбинового времени менее чувствителен по сравнению с активированным частичным тромбопластиновым временем.
Уменьшение протромбинового времени или возрастание процента протромбина по Квику не имеют клинического значения, хотя и способны отражать гиперактивность факторов внешнего пути (в том числе при нарушениях процедуры взятия крови).
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест протромбинового времени - один из базовых методов исследования коагуляционных свойств плазмы и цельной крови. Определение протромбинового времени используют для контроля лечения антикоагулянтами непрямого действия, выявления изменений количества и активности факторов протромбинового комплекса (VII, X, V и II) и оценки белоксинтезирующей функции печени. Значительное возрастание протромбинового времени часто связано с риском кровотечений.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СКРИНИНГОВЫХ КОАГУЛЯЦИОННЫХ ТЕСТОВ
Изолированное удлинение активированного частичного тромбопластинового времени:
в согетании с кровотогивостью - недостаточность/дефект факторов VIII, IX, XI;
при отсутствии кровотогивости - недостаточность/дефект факторов XII, XI, высокомолекулярного кининогена, присутствие волчаночного антикоагулянта.
Изолированное удлинение протромбинового времени;
недостаточность/дефект фактора VII (редкое состояние).
Сочетанное удлинение удлинение активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени;
действие лекарств - антикоагулянтов, варфарина, массивных трансфузий;
патологигеские состояния - активированное частичное тромбопластиновое время крови, патология печени, дефицит витамина К;
редко встрегаемые состояния - дисфибриногенемии, недостаточность/ дефект факторов X, V, II.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка при добавлении стан-дартного раствора тромбина к исследуемой цитратной плазме при 37 °С. При этом время реакции зависит в основном от концентрации и свойств фибриногена, а также наличия и действия антитромбинов.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К исследуемой бедной тромбоцитами плазме при 37 °С добавляют раствор тромбина и определяют время образования фибринового сгустка (автоматически или вручную). Параллельно тестируют нормальную плазму.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 14-17 с (в зависимости от активности тромбина).
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
При наличии гепарина в исследуемой плазме тромбиновое время может увеличиваться до 120 с и более. Если необходимо исключить эффект антикоагулянта, плазму предварительно обрабатывают сорбентом гепарина, центрифугируют и исследуют супернатант.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют РНП-плазму; коэффициент вариации значений тромбинового времени обычно не превышает 5%. Каждой лаборатории рекомендуют определить свои референтные значения (с учетом конкретных условий).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Удлинение тромбинового времени может быть вызвано присутствием в крови прямых антикоагулянтов, парапротеинов, гипофибриногенемией, дисфибриногенемией (качественный дефект фибриногена) или накоплением в крови продуктов деградации фибрина и фибриногена, которые обладают антитромбиновой активностью и препятствуют полимеризации мономеров фибрина.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тромбиновое время - один из базовых методов исследования коагуляционных параметров плазмы. Тест проводят для выявления нарушений на этапе превращения фибриногена в фибрин, зависящем в основном от количества фибриногена и ингибиторов фибринообразования - гепарина др. Значительное удлинение тромбинового времени свидетельствует о риске развития кровотечений. Рептилазное время (батроксобиновое, анцистроновое)
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Определяют время образования фибринового сгустка в цитратной плазме под действием тромбиноподобного ферментного препарата змеиного яда - батроксобина или анцистрона, напрямую отщепляющего фибринопептид А от фибриногена и образующего активные фибрин-мономеры, которые в ходе полимеризации формируют сгусток. Тест нечувствителен к гепарину и его комплексу с антитромбином.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К плазме добавляют один из указанных препаратов змеиного яда, содержащих ферменты прямого фибринообразования. Определение проводят аналогично тесту тромбинового времени; сравнивают время свертывания исследуемой и нормальной плазмы.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рептилазное время уменьшается при гиперфибриногенемии и удлиняется при снижении фибриногена и некоторых дисфибриногенемиях, а также при гиперфибринолизе и наличии в кровотоке большого количества продуктов деградации фибрина, затрудняющих полимеризацию фибрин-мономеров. Тест можно проводить в присутствии гепарина. На результаты не влияют антитела к факторам свертывания и волчаночному антикоагулянту.
Фибриноген (концентрация)
Фибриноген - основа для образования фибриновых сгустков - синтезируется в печени и постоянно присутствует в плазме. От его молекул под действием тромбина отщепляются фибринопептиды и образуются фибрин-мономеры, которые затем самопроизвольно полимеризуются и перекрестно «сшиваются».
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Хронометрический метод предполагает определение времени образования фибринового сгустка при добавлении избытка высокоактивного тромбина к разведенной в 10 раз плазме (для снижения влияния антитромбиновых компонентов) при 37 °С. В этих условиях время реакции зависит в основном от концентрации фибриногена, которая определяется по калибровочному графику. Реже применяемый турбидиметрический кинетический метод сводится к двух-точечному определению скорости нарастания мутности среды при образовании фибрина после добавления к разведенной плазме тромбопластин-кальциевого реагента или препарата змеиного яда.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. При взятии капиллярной крови ее сразу перемешивают в пропорции 1:1 с антикоагулянтом. Материал для исследования стабилен в течение 8 ч при хранении в закрытой пластиковой или силиконированной стеклянной пробирке. Во избежание возможного искажения результатов нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки, следы гемолиза, а также полученную более чем за 8 ч до анализа.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Хронометрический метод требует предварительного построения калибровочного графика путем разведения стандартной нормальной плазмы буферным раствором для получения калибровочных проб, эквивалентных плазме с содержанием фибриногена от 1 до 6 г/л. Исследование проводят на коагулометре при 37 °С; к калибровочным пробам и разведенной буферным раствором в 10 раз исследуемой плазме добавляют раствор тромбина и определяют время до образования сгустка. Концентрацию фибриногена в исследуемой плазме находят по калибровочному графику. Если она превышает 5-6 г/л, для получения корректных данных рекомендуют повторить определение, разведя плазму буферным раствором не в 10, а в 20 раз, полученный результат умножить на 2.
Турбидиметрический метод схож с тестом рептилазного времени, но исследование проводят не на коагулометре, а на фотометрическом анализаторе, позволяющем определить кинетику нарастания мутности среды. Скорость помутнения при образовании фибрина зависит от исходной концентрации фибриногена в плазме, которая определяется по результатам исследования калибровочных проб (требуется многоточечная калибровка). Турбидиметрический метод используют в некоторых автоматических анализаторах гемостаза, в этом же тесте можно одновременно определить протромбиновое время.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
У взрослых - 1,8-4,0 г/л, у новорожденных - 1,2-3,0 г/л.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Хронометрический метод может давать некорректные результаты при дисфибриногенемии, а также при попадании в кровь большого количества гепарина (например, из венозного катетера). При исследовании капиллярной крови результат зависит от действия множества дополнительных интерферирующих факторов (форменных элементов крови, разного гематокрита), что снижает точность метода.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества определения фибриногена используют контрольную РНП-плазму, для калибровки - разведения стандартной плазмы либо стандартные растворы фибриногена. Разброс результатов при работе с одной и той же пробой плазмы не должен превышать 5%. Показания разных методов на одной и той же пробе плазмы могут существенно отличаться друг от друга, особенно при гипо- или гиперфибриногенемии. Именно поэтому в лаборатории рекомендуют придерживаться какого-либо одного метода, тщательно отладив его и регулярно проводя калибровку и контроль качества.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Фибриноген синтезируется в печени и относится к группе белков острой фазы. Повышение его концентрации в плазме возможно при любой острофазовой реакции (воспалении, инфекциях, ожогах, травмах, в послеоперационном периоде, остром инфаркте миокарда), а также при болезнях почек, системных заболеваниях соединительной ткани, злокачественных новообразованиях и др. У здоровых женщин уровень фибриногена возрастает при беременности, введении эстрогенных препаратов и во время менструации.
Основные причины снижения содержания фибриногена - гиперпотребление при образовании большого количества микросгустков, распад в результате действия фибринолитических препаратов (стрептокиназы и т. п.) или нарушение синтеза при тяжелой патологии печени (циррозе, острой дистрофии), а также значительная гемодилюция. Необходимо учитывать, что тяжелые гнойно-воспалительные процессы, приводящие к развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания, могут способствовать повышению уровня фибриногена как острофазного белка и тем самым маскировать его усиленное потребление.
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение концентрации фибриногена - базовый метод исследования коагуляционных свойств плазмы, входящий во все скрининговые схемы. Исследование проводят для выявления причины и оценки степени риска кровотечений и тромбозов. При увеличении концентрации фибриногена резко повышается вязкость крови, но ее свертывание in vitro не ускоряется. Длительно повышенная концентрация фибриногена опасна, поскольку возрастает риск тромбозов и ишемии органов и тканей. При уменьшении количества фибриногена ниже 1 г/л возможны кровотечения.
Фактор VIII (активность)
Плазменный фактор VIII (антигемофильный глобулин) синтезируется в печени, селезенке, клетках эндотелия, лейкоцитах, почках. В крови фактор VIII находится в комплексе с фактором фон Виллебранда, который стабилизирует фактор VIII и существенно увеличивает период его циркуляции (до 12-24 ч). При воздействии минимального количества тромбина фактор VIII высвобождается из комплекса и проявляет свой прокоагулянтный эффект.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. В связи с малой стабильностью фактора VIII плазма должна быть получена в кратчайшие сроки. В свежезамороженной плазме при быстром и правильном оттаивании активность фактора VIII мало отличается от свежей плазмы.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В клоттинговом тесте определяют активированное частичное тромбопластиновое время смеси субстратной плазмы, дефицитной по фактору VIII (
В хромогенном методе инкубация разведенной исследуемой плазмы с добавлением фактора Ха, фосфолипидов, Са2+ и избытка фактора X приводит к активации последнего, чему способствует фактор VIII. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с освобождением окрашенного я-нитроанилина. Образующийся в смеси тромбин, также способный гидролизовать хромогенный субстрат, блокируется добавляемым синтетическим ингибитором. Скорость нарастания оптической плотности при А=405 нм пропорциональна активности фактора VIII в исследуемой плазме. Смешивают препараты факторов Ха и X, фосфолипидов, добавляют разведенную буферным раствором исследуемую плазму, хромогенный пептидный субстрат и при 37 °С определяют скорость нарастания оптической плотности при V=405 нм кинетическим методом. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом, результат выражают в процентах стандартной нормальной плазмы. Каждый образец исследуют дважды, вычисляют среднеарифметическое значение. Диапазон линейности метода - от 0 до 130%.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Те же, что в тесте активированного частичного тромбопластинового времени. Активность фактора VIII нельзя определять при наличии в пробе гепарина или на фоне его действия.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют контрольную плазму, активность фактора VIII в которой указывается в аттестате и соответствует нормальному (80-120%; 0,8-1,2 МЕ/мл) и патологическому уровню.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VIII наиболее часто связано с нарушением его синтеза (при гемофилии А) или появлением ингибиторных антител, а также с ускоренным распадом («незащищенностью» фактора VIII при болезни фон Виллебранда); реже - с гиперпотреблением. При уровне фактора VIII от 6 до 25% констатируют недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней, менее 1% - тяжелой степени. Существенное снижение уровня фактора VIII сопровождается кровотечением после травм и кровоизлияниями в суставы, мышцы и другие органы и ткани. При снижении активности фактора VIII в плазме менее 25% увеличивается риск развития послеоперационных кровотечений. Активность фактора VIII возрастает при острофазовых реакциях (воспалении, травмах и т. д.), беременности и лечении эстрогенными препаратами, после спленэктомии, а также может увеличиваться при сахарном диабете и опухолевом процессе. Активность фактора VIII, превышающую 175%, расценивают как тромбофилическое состояние.
Фактор IX (активность/количество)
Плазменный фактор IX, или фактор Кристмаса, синтезируется в печени (синтез зависит от витамина К). При каскадной активации внутреннего пути гемостаза активированный фактор IX в составе теназного ферментного комплекса (на фосфолипидной матрице) способствует переходу фактора X в активную форму, образованию протромбиназы, тромбина и фибринового сгустка. В процессе свертывания крови фактор IX не потребляется и остается в сыворотке.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Принцип определения клоттинговым методом такой же, как при исследовании активности фактора VIII, но в качестве субстрата используют плазму, дефицитную по фактору IX. Иммуноферментное определение основано на связывании определяемого фактора IX с фиксированными на поверхности лунки планшета моноклональными антителами к данному фактору и их конъюгатом с пероксидазой; калибровку осуществляют по разведениям стандартной калибровочной плазмы, входящей в набор.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% (0,5-1,5 МЕ/мл).
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора IX может быть связано с нарушением его синтеза (гемофилией В, тяжелыми гепатитами и циррозами печени, лечением непрямыми антикоагулянтами), а также с появлением ингибиторных антител. При уровне фактора от 25 до 50% констатируют скрытую недостаточность, от 6 до 24% - недостаточность легкой степени, от 1 до 5% - средней степени, менее 1% - тяжелую форму недостаточности. Выраженная недостаточность фактора IX сопровождается геморрагическими проявлениями, минимальный уровень активности в крови для предупреждения послеоперационных кровотечений составляет 20-25% нормы. Количество/активность фактора IX могут возрастать при лечении эстрогенными препаратами и при почечной недостаточности. Если активность фактора IX превышает 200%, развивается тромбофилическое состояние.
Фактор X(активность/количество)
Витамин К-зависимый фактор X (фактор Стюарта-Прауэра) синтезируется в печени и занимает одно из центральных мест в системе плазменного гемостаза. При каскадной активации как внутреннего, так и внешнего пути гемостаза фактор X превращается в активную протеазу - фактор Ха, который в присутствии других компонентов протромбиназного комплекса (фактора Va, фосфолипидов и Са2+) превращает протромбин в тромбин и способствует образованию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Изолированная недостаточность фактора X в исследуемой плазме может быть обнаружена по удлинению активированного частичного тромбопластинового времени и особенно протромбиновое время, которые приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются удлиненными при добавке дефицитной по ф. X плазмы.
Количественное определение фактора X в клоттинговом тесте проводят аналогично исследованию активности фактора VIII, но вместо активированного частичного тромбопластинового времени применяют тест протромбиновое время и используют плазму, дефицитную по данному фактору. Антиген к фактору X может быть определен иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител. Методом определяют количество, но он не дает представления об активности анализа. При применении хромогенного метода фактор X в разведенной исследуемой плазме переводится в активное состояние специфическими протеазами из яда гадюки Рассела (Russel Viper Venom - RVV) в присутствии Са2+. Образующийся фактор Ха гидролизует специфический хромогенный субстрат с высвобождением окрашенного нитроанилина; скорость нарастания оптической плотности при > или =405 нм пропорциональна концентрации фактора X. Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализа¬торе гемостаза с фотометрическим каналом; результаты выражаются в процентах активности фактора в стандартной плазме (линейность метода - от 10 до 130%).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150%.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Исследование необходимо провести не позднее 2 ч после взятия крови. Липемичные, иктеричные и гемолизированные образцы исследовать не рекомендуют; в противном случае необходим бланк-контроль с плазмой пациента. Для контроля качества используют нормальную и патологическую плазмы с аттестованным уровнем фактора X. Оценку метода можно проводить с использованием РНП-плазмы или свежей (свежеразмороженной) пулированной плазмы от нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора X чаще бывает связано с нарушением его синтеза в печени (дефицитом витамина К, действием непрямых антикоагулянтов, тяжелой патологией печени) или исчезновением из кровеносного русла при амилоидозе (изолированной недостаточностью фактора X). Концентрация фактора X может также снижаться при гепаринотерапии из-за связывания и инактивации комплексом «АТ-гепарин». Врожденный дефицит фактора наблюдается редко.
Исследование проводят при сочетанном удлинении активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени для выявления причины гипокоагуляции. Минимальный гемостатический уровень активности фактора X в крови - 5-10%, для послеоперационной остановки кровотечения - 10-20% нормы. Более выраженное уменьшение сопровождается кровоточивостью.
Поскольку активность синтезируемого в печени фактора X снижается под влиянием антикоагулянтов непрямого действия, наряду с активностью протромбина ее можно применять при мониторинге терапии варфарином.
Фактор VII (активность/количество)
Плазменный витамин К-зависимый фактор VII (проконвертин) синтезируется в печени и циркулирует в крови. При повреждении тканей и попадании в кровоток тканевого фактора образуется активная форма фактора Vila, которая в виде комплекса «ТФ-фактор Vila» активирует факторы IX и X, что, в свою очередь, приводит к образованию тромбина и формированию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Клоттинговый метод основан на коррекции удлиненного протромбинового времени исследуемой плазмы добавкой нормальной пулированной плазмы, но отсутствии коррекции в микс-тесте плазмы больного и субстратной плазмы, дефицитной по фактору VII. Имеется информация о хромогенном методе определения фактора VII, основанном на образовании комплекса «ТФ-VIIa», активирующего добавляемый фактор X, который впоследствии гидролизует хромогенный субстрат с образованием окрашенного я-нитроанилина. Иммуноферментный анализ (ELISA) позволяет определять как общее количество проконвертина и его комплекса с тканевым фактором (VII+VIIa+ТФ/ VII+TФ/VIIa), так и активную форму (VIIa+T/VIIa), которая в норме составляет около 1% (~5 нг/мл).
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-200%; при определении методом ELISA - 300-800 нг/мл.
ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Дополнительная нестабильность результатов в клоттинговом и хромогенном тестах связана с возможностью самопроизвольной и Холодовой активации фактора VII (плазму крови нежелательно долго выдерживать при низкой температуре). Вместе с тем быстрое замораживание плазмы мало изменяет активность данного фактора. Гепарин* в концентрации до 0,5 ЕД/мл не влияет на результаты хромогенного исследования.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют аттестованную по фактору VII контрольную плазму, РНП-плазму или свежую (свежеразмороженную) пулированную плазму от нескольких здоровых людей.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора VII возможно при нарушении его синтеза в печени (в периоде новорожденности, при тяжелой патологии органа - гепатите, циррозе, дефиците витамина К и лечении непрямыми антикоагулянтами) и при коагулопатии потребления. Врожденная недостаточность проконвертина встречается очень редко. Повышение активности фактора VII возможно при активации его синтеза в печени (действии эстрогенных препаратов, в III триместре беременности и т. д.).
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фактор VII отличается наиболее коротким периодом циркуляции в кровеносном русле (Т 1/2=4-7 ч); прогрессирующее снижение его активности может рассматриваться как один из маркеров острой печеночной недостаточности. Повышение количества/активности фактора VII расценивается как тромбофилическое состояние, может сопровождаться возрастанием риска сердечно-сосудистых заболеваний.
Фактор V(активность/количество)
Плазменный фактор V (проакцелерин) синтезируется в печени, в крови циркулирует в неактивном виде, содержится в тромбоцитах. После протеолитической активации фактор Va выступает в качестве основного кофактора фактора Ха, повышая его активность на несколько порядков. В свою очередь, фактор Ха в составе протромбиназного ферментного комплекса (факторов Ха, Va, фосфолипидов и Са2+) вызывает образование тромбина и способствует формированию фибринового сгустка.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Недостаточность фактора V может быть заподозрена в клоттинговом тесте при удлинении ПВ. Показатели приходят к норме в микс-тесте с нормальной донорской плазмой, но остаются патологическими при добавке дефицитной по фактору V плазмы. Клоттинговое определение фактора V аналогично исследованию активности фактора VIII, но проводят по тесту протромбинового времени с использованием субстратной плазмы, дефицитной по фактору V.
Количественное определение проводят ИФА-методом с использованием моноклональных антител к тяжелой цепи фактора V и конъюгата пероксидазы с поликлональными антителами к данному белку. Метод дает представление о количестве, но не о реактивности фактора.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 50-150% уровня нормальной пулированной плазмы.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности фактора V может быть связано с нарушением синтеза в печени (тяжелой патологией печени) или чрезмерным потреблением; врожденный дефицит наблюдается очень редко. Повышение активности фактора V возможно при ускорении его синтеза в печени (острой фазе заболеваний, беременности и т. д.). Исследование проводят для дифференциации причин удлинения протромбинового времени на фоне нормального активированного частичного тромбопластинового времени. Минимальный гемостатический уровень активности фактора V в крови составляет 5-15%, для выполнения операций - 25%.
Фактор XIII (фибриназа, фибринстабилизирующий фактор)
Фибриназа (фактор XIII, трансглутаминаза) путем образования перекрестных ковалентных связей стабилизирует растворимый фибрин-полимерный сгусток и превращает его в плотный тромб. Сгустки, образовавшиеся с участием фибриназы, лизируются медленно. Если же активность фактора XIII снижена, сгустки распадаются быстро, даже когда фибринолитическая активность крови нормальная.
ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Функциональное определение основано на оценке лизиса фибринового сгустка, образуемого из стандартного раствора фибриногена с добавкой различных разведений исследуемой плазмы, содержащей фактор XIII, в растворе монохлоруксус- ной кислоты (или оксалата мочевины). Метод достаточно субъективен на стадии оценки результатов. Фотометрический энзиматигеский метод основан на действии фактора XIHa, на синтетическом субстрате и определении количества отщепляющихся ионов аммония в глутаматдегидрогеназной реакции на фотометре или биохимическом анализаторе. Иммуноферментный метод (ELISA) на основе поликлональных антител к эпи-топам молекулы фактора XIII высокочувствителен и обладает хорошей воспро-изводимостью. Метод позволяет определять количество фибриназы, но не дает информации об ее активности.
ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. Плазма должна быть исследована не более чем через 4 ч после взятия крови. Нежелательно исследовать плазму, имеющую сгустки и следы гемолиза. Допустимо однократное замораживание плазмы с последующим оттаиванием в теплой воде.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
К последовательным разведениям исследуемой плазмы буферным раствором (от 1:2 до 1:512) добавляют стандартный раствор фибриногена, суспензию каолина и тромбин-кальциевую смесь. В ходе 30-минутной инкубации при 37 °С образуется сгусток фибрина, в разной степени упрочненный действием фактора XIII. После добавления монохлоруксусной кислоты и 5-минутной инкубации встряхивают пробирки и отмечают наименьшее разведение плазмы, при котором сгусток разрушается на мелкие фибриновые нити. Параллельно тестируют аналогичные разведения входящей в набор плазмы-калибратора с известной активностью фибриназы (в процентах нормальной плазмы). Уровень фактора XIII рассчитывают по наименьшим титрам плазмы, в которых произошел распад сгустка, с учетом известной активности фактора XIII в плазме-калибраторе.
РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 60-150% уровня нормальной плазмы.
ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества анализа используют контрольные плазмы с нормальными и патологическими уровнями фактора XIII. Функциональный метод не может быть стандартизирован, поскольку оценка распада сгустка в значительной степени субъективна.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение фактора XIII в крови может быть связано с нарушением его синтеза либо с гиперпотреблением. Активность фибриназы бывает сниженной у новорожденных и детей первого месяца жизни. Приобретенный дефицит фактора XIII может развиваться у больных с лучевой болезнью, лейкозами, гепатитами и циррозами, метастазами опухолей в печень, лимфомой. Описано существенное снижение активности фактора XIII (
КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клиническая значимость теста в целом невелика. Снижение или повышение активности фибриназы рассматривают как фактор геморрагического или тромботического риска. Вместе с тем считается, что 10% фибриназы обеспечивают полноценный гемостаз, а 2% этого фактора достаточны для остановки кровотечения.
Методы исследования свертывающей системы крови включают следующие группы:
Таким образом, при оценке состояния свертывающей системы крови используются как собственно коагуляционные методики (лабораторные и инструментальные), составляющие основу диагностического процесса, так и иммунологические, радионуклидные и другие виды исследования . При этом во многих случаях компоненты системы могут определяться как по функциональной активности, так и иммунологически - по содержанию соответствующего антигена в крови. Параллельное использование таких методик позволяет дифференцировать формы патологии, связанные с отсутствием синтеза соответствующего фактора свертывания (в этом случае одинаково снижены как его функциональная активность, так и количество антигена), и формы, при которых молекула фактора синтезируется, но она аномальна и функционально неполноценна.
Для обозначения первых форм к номеру соответствующего фактора добавляется знак «-» (например, VIII-, IX- и т. д.), а во втором - знак «+» (например, VIII+, IX+).
Определение времени свертывания крови (предпочтительнее методике Ли-Уайта) - давно применяющийся быстровыполнимый (непосредственно у постели больного) ориентировочный тест, позволяющий выявлять значительные нарушения свертываемости крови, связанные с дефицитом факторов гемокоагуляции (кроме фактора VII) или с действием антикоагулянтов и фибринолитиков. Используется в качестве ориентировочного теста и для контроля за гепаринотерапией, устранения действия гепарина протаминсульфатом. Тест сравнительно низкочувствительный, показатели его нарушаются лишь при выраженном снижении содержания в плазме факторов свертывания (ниже 4-5 %), в связи с чем непригоден для выявления легких форм гемофилии A и B, а также нарушений свертываемости крови при ангиогемофилии, дефиците фактора XI, прекалликреина и высокомолекулярного кининогена. По этим причинам тест не может использоваться для предоперационного обследования больных: при нормальных показателях теста (5-10 мин) возможно возникновение профузных послеоперационных кровотечений.
Время рекальцификации плазмы - нестандартизированный низкочувствительный тест, менее надежен для выявления гипокоагуляции, чем время свертывания цельной крови. Не может быть рекомендован для диагностики нарушений гемостаза.
Активированное парциальное тромбопластиновое время плазмы (АПТВ, каолин-кефалиновый тест) - высокочувствительный метод, выявляющий нарушения свертываемости крови при запуске процесса по внутреннему механизму. Избирательно чувствителен к дефициту плазменных факторов свертывания (поскольку дефицит тромбоцитов и фактора 3 тромбоцитов компенсирован вводимым извне кефалином или эритрофосфатидом).
Используется для контроля за гепаринотерапией, предоперационного обследования больных и т. д. Нормативные показатели зависят от используемых образцов кефалина, в большинстве случаев составляют 37-50 с (оптимально - 37-45 с).
Каолиновое время плазмы - тест, сходный с предыдущим, но без добавления в плазму кефалина (эритрофосфатида), в результате чего он чувствителен не только к дефициту плазменных факторов свертывания, но и к недостатку тромбоцитов и фактора 3 тромбоцитов. Ориентировочная оценка активности этого фактора может быть проведена путем сравнения каолинового времени плазмы исследуемого с высоким и низким содержанием тромбоцитов (норма - 57-70 с).
Не рекомендуется использование фосфолипидных компонентов, дающих в АПТВ время свертывания равное 55 с и более, так как при этом резко снижается точность и воспроизводимость тестов, в том числе при количественном определении факторов VIII и IX.
Силиконовое время плазмы - это время рекальцификации плазмы, полученной в условиях силиконирования игл, пробирок, пипеток, т. е. при минимальной контактной активации. Тест чувствителен к гиперкоагуляции-внутрисосудистой активации пусковой контактной фазы (факторов XII и XI), однако это нарушение более четко выявляется путем определения силиконового времени свертывания цельной крови (на основе метода Ли-Уайта либо тромбоэластографической регистрации процесса в силиконированной кювете).
Нормативные показатели зависят от используемого силикона и определяются исследованием крови здоровых людей для каждого его образца отдельно. При выборе силикона лучшим является тот, который в наибольшей степени удлиняет время свертывания крови (плазмы).
Протромбиновое (тромбопластиновое) время плазмы (время Квика, протромбиновый индекс) характеризует скорость свертывания рекальцифицированной плазмы крови при запуске процесса по внешнему механизму, т. е. при добавлении тромбопластина мозга человека (или кролика).
Активность тромбопластина стандартизируется на смешанных образцах нормальной (контрольной) плазмы. Чаще всего используются тромбопластины активностью 12-18 с (в классической методике Квика- 12-13 с). Чем слабее тромбопластин, тем больше ошибка метода.
При нормальном протромбиновом времени плазмы тест позволяет выявить изолированный или совокупный дефицит факторов протромбинового комплекса - VII, X, V и II, из которых три фактора (VII, X и II) К-витаминозависимы и их активность снижается под влиянием антикоагулянтов непрямого действия. В связи с этим протромбиновый тест является основным при контроле за дозировкой кумаринов (неодикумарин, или пелентан, синкумар и др.) и других препаратов этой группы (фенилин).
Протромбиновое время остается нормальным при дефиците факторов внутреннего механизма активации протромбиназы - факторов XII, XI, IX, VIII (т. е. при всех видах гемофилии и дефекте Хагемана), а также при дефиците прекалликреина и высокомолекулярного кининогена (ВМ кининогена)
В литературе принято разное обозначение результатов протромбинового теста . Наиболее целесообразно указывать протромбиновое время исследуемой и контрольной плазмы крови в секундах (что дает информацию и об активности использованного тромбопластина). Иногда пользуются соотношением этих двух величин, т. е. индексом (ПВ исследуемой плазмы, с,)/(ПВ контрольной плазмы, с) , (норма 0,9-1,1).
Другой формой оценки этого показателя, которой наиболее широко пользуются в лабораториях, является вычисление протромбинового индекса в процентах путем составления обратной арифметической пропорции (норма - 90-110%), однако такой расчет является неправильным, так как между концентрацией факторов свертывания и временем свертывания имеется не арифметическая, а логарифмическая зависимость. Кроме того, протромбиновый тест чувствителен лишь к снижению факторов свертывания ниже 50 % их нормальной величины. В силу этого целесообразно использование определения протромбинового индекса в процентах по кривой разведения (1:2, 1:4, 1:8 и т. д.) смешанного образца нормальной плазмы. Такая кривая строится однократно для тромбопластинов разной исходной активности (от 12 до 18 с) и по ней определяется протромбиновый индекс у исследуемых больных. Преимущество такой методики состоит также в том, что результаты всех исследований, в том числе и выполняемых в динамике в разные дни, соотносятся не к случайным различным образцам нормальной плазмы крови, а к усредненным одним и тем же стандартным параметрам, вследствие чего существенно уменьшается ошибка метода. Индексы, полученные по пропорции и по кривой разведения нормальной плазмы, совершенно не соответствуют друг другу. Это следует учитывать и при контроле за действием непрямых антикоагулянтов, ибо снижение обычного индекса до 50 % примерно соответствует снижению индекса по кривой разведения до 25-30 % В связи с этим в анализах всегда следует указывать, как рассчитывался протромбиновый индекс, каковы его нормативные показатели для тромбопластина данной активности.
Тромбиновое время плазмы, т. е. время свертывания цитратной плазмы при добавлении к ней тромбина стандартной активности, является основным тестом для оценки конечного этапа свертывания крови. Учет этого показателя важен для правильного толкования всех остальных коагуляционных тестов, ибо нарушение конечного этапа свертывания крови неизбежно должно привести к удлинению времени свертывания во всех перечисленных выше методиках.
В большинстве случаев при проведении тромбинового теста используется такая концентрация раствора тромбина, которая при смешивании с равным объемом плазмы крови дает свертывание за 12- 18 с, но при распознавании дисфибриногенемий используются и более слабые его концентрации (приводящие к свертыванию за 30-35 с).
Тромбиновое время - важный диагностический показатель, нарушение его наблюдается как при врожденных, так и при часто встречающихся приобретенных (вторичных) гипопротромбинемиях, при большинстве дисфибриногенемий, а также под влиянием гепарина, продуктов фибринолиза (ПДФ) и ряда других антитромбинов и ингибиторов самосборки мономеров фибрина. В силу этого тромбиновое время в первую очередь и в большей степени нарушается при острых и подострых ДВС-синдромах, что играет важную роль для экспресс-диагностики этой патологии.
Аутокоагуляционный тест (АКТ) - высокочувствительный двухступенчатый, характеризует процесс свертывания крови при запуске его по внутреннему механизму. Как и АПТВ, тест не чувствителен к дефициту фактора VII, но вместе с тем его показания не зависят от содержания фибриногена (фактора I) в исследуемой плазме крови, чем он отличается от всех остальных ориентировочных коагуляционных проб.
Другое достоинство АКТ состоит в том, что исследуется разведенная кровь, благодаря чему существенно повышается чувствительность теста к дефициту факторов свертывания и, кроме того, выполнение АКТ не требует использования каолина и кефалина, поскольку стандартизация контактной и фосфолипидной активации в нем достигается гемолизатом собственных эритроцитов исследуемого.
Сущность АКТ состоит в том, что к 2 мл гипотонического раствора (0,222 %) хлорида кальция добавляется 0,1 мл крови исследуемого.
В этой гемолизат-кальциевой смеси происходит образование протромбиназы и тромбина, активность которых определяется последовательным добавлением 0,2 мл этой смеси к 0,2 мл плазмы исследуемого (через каждые 2 мин на протяжении первых 10 мин, а затем - через каждые 10 мин в течение 1 ч).
Плазма исследуемого является источником фибриногена, на котором тестируется активность образующегося в смеси тромбина. Как показали многочисленные исследования, она может быть заменена плазмой крови здоровых людей или раствором фибриногена. В этом случае расход крови больного сокращается до 0.1-0,2 мл (может быть взята из пальца!), что трансформирует аутокоагуляционный тест в микрокоагуляционный (МКТ) и делает его очень удобным для использования в педиатрии, в том числе при исследовании гемостаза у новорожденных.
Коагуляционная активность в АКТ и МКТ вначале нарастает и у здоровых людей обычно достигает максимума к 10-й минуте, инкубация кровь-кальциевой смеси (ККС), когда свертывание субстратной плазмы происходит за 10±1 с. Затем коагуляционная активность ККС начинает снижаться, что свидетельствует об инактивации образовавшегося в ней тромбина. При гемофилиях, действии гепарина и других нарушениях свертываемости коагулирующая активность ККС резко снижается, а максимум перемещается с 10-й минуты на более поздний срок. При гиперкоагуляции наблюдается более раннее и более значительное нарастание тромбиновой активности в ККС.
При проведении теста в одной пробирке (определение только на 10-й минуте инкубации ККС) он может быть использован для контроля за гепаринотерапией. Преимущество этой методики перед тестом активированного парциального тромбопластинового времени состоит в том, что в ней нивелируется неодинаковое влияние разных кефалинов на гепариновое время свертывания.
На основе АКТ (МКТ) разработана простая и точная методика дифференциальной диагностики гемофилий.
С помощью приводимых в справочниках переводных таблиц показания АКТ (МКТ) могут быть выражены в процентах и изображены в виде графика - аутокоагулограммы.
Для оценки ряда общих параметров свертываемости крови широко используются и инструментальные методы исследования, преимущественно с применением различных коагулографов и тромбоэластографов.
Тромбоэластография дает представление не только о временных параметрах свертывания крови или плазмы, но и о структуре и механических свойствах образующихся сгустков. В последние годы и в аппаратные методы регистрации вводится стандартизация контактной и фосфолипидной активации процесса свертывания. Создаются также коагулограммы для массового выполнения общих коагуляционных тестов - АПТВ, протромбинового, тромбинового и других с автоматической записью результатов.
Приведенные ниже в таблице данные показывают, что ориентировочное исследование свертываемости крови с помощью трех основных тестов позволяет провести групповое разграничение дефицита различных плазменных факторов гемокоагуляции. Так, замедление свертываемости только в протромбиновом тесте (I тип нарушения) при нормальных показаниях всех остальных характерно для наследственного дефицита фактора VII либо для снижения уровня этого фактора на ранних этапах развития механической желтухи или в первые 1-2 дня лечения антикоагулянтами непрямого действия, когда подавление синтеза фактора VII опережает в своем развитии снижение уровня всех остальных К-витаминозависимых факторов свертывания.
|
Типы нарушений основных коагуляционных тестов при дефиците тех или иных плазменных факторов свертывания |
||||
|
Тип нарушений |
Коагуляционные тесты |
|||
|
АПТВ, АКТ |
||||
|
Фактор Виллебранда |
||||
|
Плазменный прекалликреин |
||||
|
ВМ кининоген |
||||
|
Антикоагулянты прямого действия (гепарин, гепариноиды и др.) |
||||
|
Антикоагулянты непрямого действия (кумарины) |
||||
|
Примечание. (+) - замедление свертывания; (-) - отсутствие нарушения свертывания. |
||||
Нарушение только внутреннего механизма свертывания, т. е. активированного парциального тромбопластинового времени и АКТ (II тип), наблюдается при дефиците факторов XII, XI, IX, VIII, Виллебранда (не при всех формах), прекалликреина и ВМ кининогена. Из них при наследственных дефектах свертываемости дефицит факторов XII, прекалликреина и ВМ кининогена наблюдается крайне редко и не сопровождается какой-либо кровоточивостью, тогда как дефицит факторов VIII (гемофилия А), IX (гемофилия В) и фактора Виллебранда встречается очень часто (составляет более 96 % всех наследственных коагулопатий) и сопровождается выраженной кровоточивостью. Между ними в первую очередь и проводится дальнейшая дифференциальная диагностика.
Дефицит фактора XI встречается сравнительно редко (около 0,5-1,0 % всех гемофилий), протекает с очень слабо выраженной кровоточивостью (в основном после травм и операций) и занимает промежуточное место между первой подгруппой бессимптомных нарушений и гемофилиями и болезнью Виллебранда.
Еще один тип нарушений характеризуется удлинением как парциального тромбопластинового времени и АКТ, так и протромбинового времени. Он характерен для дефицита факторов V, X или II либо для комплексного дефицита всех К-витаминозависимых факторов (VII, X, IX, II), что наблюдается при механической желтухе и других видах К-витаминной недостаточности, а также при приеме антикоагулянтов непрямого действия.
И наконец, как видно из той же таблицы, возможно нарушение показаний всех трех тестов (IV тип), что наблюдается при наследственных и приобретенных гипо- и дисфибриногенемиях (не всех), при приеме антикоагулянтов прямого действия (гепарина, гепариноидов, гирудина и др.), лечении активаторами фибринолиза и дефибринирующими препаратами (стрептокиназа, урокиназа и др.), появлении в крови патологических антитромбинов и веществ, препятствующих соединению (сборке) фибрин-мономеров - парапротеинов, криоглобулинов, иммунных комплексов, а также при сложных нарушениях свертываемости, обусловленных ДВС-синдромом. При этом тромбиновое время часто нарушается в большей степени и несколько раньше, чем другие тесты.
При учете давности заболевания и возможности его наследственного генеза либо вторичной связи с другими видами патологии и лекарственными или иными воздействиями, наличия или отсутствия кровоточивости и ее типа удается правильно определить генез этих глубоких нарушений свертывания крови.
Все дифференцирующие тесты основаны на принципе коррекции , т. е. на определении, в какой степени выявленное нарушение свертываемости крови устраняется или, наоборот, не устраняется образцами плазмы крови или искусственно полученными препаратами крови с заведомо известным дефицитом того или иного фактора свертывания.
С этой целью специализированные лаборатории создают для себя коллекции фактородефицитных плазм крови, получая их от больных с заведомо установленным глубоким (менее 1 %) дефицитом каждого из факторов и хранят их в мелкой расфасовке (по 0,5 мл) при температуре - 30 °С. При необходимости эти образцы размораживают и используют в диагностических тестах.
Плазма, подвергшаяся случайному размораживанию или оставшаяся неиспользованной, повторному замораживанию не подлежит. В коррекционных тестах не следует использовать плазму с иммунными ингибиторами того или иного фактора. В диагностических наборах ряда фирм содержатся лиофильно высушенные образцы плазмы крови с дефицитом определяемых факторов свертывания (субстратные плазмы). Однако многие нарушения свертываемости крайне редко наблюдаются в клинической практике, в связи с этим используются искусственно приготовленные компоненты нормальной крови с дефицитом тех или иных факторов свертывания, а также гетерогенные плазмы (цыплят, утят и др.).
В таблице приведены сведения о содержании факторов свертывания крови в компонентах крови, используемых для проведения коррекционных коагуляционных тестов в зависимости от сроков их хранения. Пользуясь этой таблицей, легко расшифровать показания любого из трех основных коагуляционных тестов. В коррекционных методиках такого рода используются тесты, стандартизированные по контакту и фосфолипидной активации, т. е. каолин-кефалиновые или с применением гемолизата (в АКТ).
|
Плазма крови |
Фактор свертывания |
|
|
внутреннего механизма |
внешнего механизма |
|
|
VIII IX XI XII прекалликреин |
VII X V II |
|
|
Нативная (со сроком хранения до 18 ч) |
||
|
Адсорбированная * |
||
|
Со сроком хранения более 24 ч |
||
|
Со сроком хранения 2-4 дня (при температуре +4°С) |
Не используется |
|
|
Профильтрованная ** |
Не используется |
|
|
Нативная плазма цыплят или утят (в возрасте до 3-4 дней) |
Не используется |
|
|
Примечание. (+) - наличие фактора; (-) - отсутствие. |
||
|
* Адсорбция производится либо сульфатом бария из оксадаткой плазмы (BaSO 4 -плазма). либо гелем гидроокиси аллюминня из цитратной плазмы (Al(OH) 3 -плазма). |
||
|
** Фильтрация производится через два асбестовых фильтра (фильтры Зейца) - с 20 % (верхний фильтр) и 30 % (нижний фильтр) содержанием асбеста либо через удвоенный или утроенный соответственно 30 и 20 % фильтры. |
||
Определяют активированное парциальное тромбопластиновое время в исследуемой плазме крови, нормальной плазме (контроль) и в плазме с заведомо известным дефицитом факторов VIII (от больного гемофилией А), IX (от больного гемофилией В), XI и XII. Затем готовят смесь из образцов цитратной плазмы исследуемого (7/10 объема) и последовательно с каждой из дефицитных плазм (3/10 объема), начиная с дефицита фактора VIII и IX (наиболее частые формы патологии! ).
К смеси добавляют каолин и кефалин, и через 2 мин подвергают ее рекальцификации (при температуре 37 °С). В той смеси, где активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется, имеется один и тот же дефект свертывания.
Так, если у обследуемого больного активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется добавлением плазмы крови больного с заведомо известным дефицитом фактора VIII, но корригируется плазмой крови больного с дефицитом фактора IX, у него имеется гемофилия А .
Аналогично, но на основе протромбинового теста дифференцируют дефицит факторов протромбинового комплекса (X, V, VII и II).
Для дифференциации нарушений внутреннего механизма свертывания крови чаще всего используется классический тест генерации тромбопластина с заменой тромбоцитарного компонента, приготовление которого требует значительной затраты времени и крови, кефалином Недостатками теста генерации тромбопластина являются его громоздкость, необходимость приготовления большого числа реагентов, значительная затрата времени на его выполнение.
Задачам экспресс-диагностики вполне отвечает другой коррекционный тест, основанный на проведении коррекции теми же компонентами нормальной крови на базе аутокоагуляционного теста.
Этот тест отличается высокой надежностью, быстротой и легкостью выполнения и требует небольшого (не более 0,5 мл) количества крови исследуемого, что позволяет использовать его в педиатрической практике.
В нем, как и в тесте генерации тромбопластина, используют для коррекции адсорбированную плазму и старую сыворотку крови, которую повторно центрифугируют перед проведением исследования. В три пробирки разливают по 2 мл 0,222 % раствора хлорида кальция и в две из них добавляют 0,1 мл адсорбированной нормальной плазмы крови (1-я пробирка) и 0,1 мл старой нормальной сыворотки крови (2-я пробирка). В три другие пробирки вносят по 0,2 мл нормальной цитратной плазмы. Затем во все пробирки с раствором хлорида кальция добавляют по 0,1 мл цитратной крови исследуемого.
Ровно через 4 мин инкубации этой смеси ее свертывающую активность тестируют на нормальной плазме.
Резкое снижение коагулирующей активности только в первой пробирке (с нормальной BaSO 4 -плазмой) свидетельствует о наличии у больного дефицита фактора IX (гемофилия В), только во второй пробирке (со старой сывороткой) - о дефиците фактора VIII (гемофилия А); если коррекция происходит в обеих пробирках (одинаково сильная), то, очевидно, имеется дефицит фактора XI или XII (см. табл. 14).
|
Коагуляционные тесты, дифференцирующие нарушения свертывания крови по внутреннему механизму (при нормальном протромбиновом и тромбиновом времени) |
|||
|
Дефицитные факторы в исследуемой плазме крови |
|||
|
Адсорбированная плазма (без фактора IX) |
Старая сыворотка (без фактора VIII ) |
Смесь адсорбированной плазмы и старой сыворотки |
|
|
Фактор VIII |
|||
|
Факторы XI или XII |
|||
Данный тест высокочувствителен, так как исследование проводится на разведенной в 20 раз крови при компенсации фактора 3 тромбоцитов гемолизатом. Единственный используемый реактив - гипотонический раствор хлорида кальция, что делает пробу общедоступной.
Столь же простой является методика коррекционных проб, выполняемых на основе протромбинового теста для дифференциации дефицита факторов II, V и VII+, X (в таблице).
|
Коагуляционные тесты, дифференцирующие дефицит факторов II, V и V II+, +Х, выполняемые на основе протромбинового теста (при нормальном тромбиновом времени) |
||||
|
Дефицитные факторы в исследуемой плазме крови |
Компоненты нормальной крови, добавляемые к исследуемой плазме |
|||
|
Адсорбированная плазма (без факторов II, VII, X) |
Старая плазма (без фактора V) |
Профильтрованная плазма (без факторов VII и X ) |
Старая сыворотка (без факторов II и V ) |
|
|
Факторы VII или X |
||||
|
Примечание. (+) - нормализация свертывания; (-) - отсутствие нормализации свертывания. |
||||
Для того чтобы разграничить дефицит факторов VII и X, выполняется дополнительный коагуляционный тест с добавлением к исследуемой плазме крови раствора яда змеи гюрзы - препарат лебетокс (подбирается такая концентрация яда, которая в присутствии кефалина и хлорида кальция вызывает свертывание за 20-25 с; все ингредиенты берутся в количестве 0,1 мл и смешиваются) (таблица ниже).
С этой же целью используется препарат яда гадюки Расселла, обитающей в Индии (препарат стипвен ).
|
Коагуляционные тесты, дифференцирующие дефицит факторов VII и X с помощью яда гюрзы (лебетокс) |
|||
|
Дефицитные факторы в исследуемой плазме крови |
Тесты |
||
|
с ядом гюрзы+кефалин+хлорид кальция |
с ядом гюрзы+кефалин+хлорид кальция+профильтрованная плазма крови (источник факторов V а VIII) |
протромбиновый |
|
|
Фактор VII |
|||
|
Примечание. (+) - нормализация свертывания; (-) - отсутствие нормализации свертывания. |
|||
Дифференциальную диагностику завершают при необходимости количественным определением дефицитных факторов или их специфических иммунных ингибиторов, для чего применяются специальные высокочувствительные стандартизированные методики. В этих методиках используется построение кривых разведения смешанных образцов нормальной плазмы крови с коррекцией дефицита всех факторов, кроме исследуемого. По этим кривым определяется активность исследуемого фактора в плазме больных.
Особенно важно количественное определение концентрации факторов VIII и IX, а также наличия их ингибиторов у больных гемофилией А и В (особенно до и во время хирургических вмешательств и при проведении интенсивной заместительной терапии), а также при отсроченных профузных послеродовых кровотечениях, когда приходится дифференцировать ДВС-синдром и более редкую патологию - появление иммунного ингибитора фактора VIII (еще намного реже - фактора V).
При глубоком дефиците фактора XIII (очень редкая наследственная патология) все коагуляционные пробы нормальны, но сгустки растворяются в 5М или 7М мочевине.
Помогает дифференцировать дефицит различных факторов свертывания также и учет степени и, особенно, сроков нормализации показаний тестов после внутривенного введения больным препаратов крови, т. е. учет коррекции in vivo по методике Л. 3. Баркагана .
Особенно эффективна эта методика при большой разнице продолжительности жизни дифференцируемых факторов в циркуляции. Так, продолжительность полужизни факторов протромбинового комплекса варьирует от нескольких часов (фактор VII) до нескольких дней (фактор II). Промежуточное положение между ними занимают факторы X (2-2,5 дня) и V (12-18 ч).
Поэтому после массивной струйной трансфузии плазмы протромбиновый индекс повышается при дефиците фактора VII очень кратковременно, при дефиците фактора V - несколько более длительно (примерно в 4-6 раз), а при дефиците факторов X и, особенно, II на более продолжительный срок (свыше 1-2 суток). Показательно в этом отношении и влияние на протромбиновый индекс препарата ППСБ (концентрата факторов VII, IX, X и II). Он также кратковременно нормализует протромбиновое время при дефиците фактора VII и более длительно (во много раз!) при дефиците факторов X и II. Поскольку в этом препарате отсутствует фактор V, данный дефицит им не корригируется.
Аналогичное различие выявляется при трансфузионной и заместительной терапии факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX и VIII), что регистрируется активированным парциальным тромбопластиновым тестом.
Особый интерес представляет динамика коррекции уровня фактора VIII и показаний АПТВ при трансфузионной терапии гемофилии А и болезни Виллебранда . При первом из этих заболеваний выявляется немедленное максимальное улучшение свертываемости после трансфузии (струйно, быстро!) антигемофильной плазмы или введения криопреципитата, а затем довольно быстрое (за 10-18 ч) неуклонное снижение ее, тогда как при болезни Виллебранда наблюдается некоторое нарастание свертывающей активности в течение нескольких часов после трансфузии, а затем ее снижение - намного более медленное, чем при. В связи с этим при лечении болезни Виллебранда более редко прибегают к заместительным трансфузиям, чем при гемофилии А.
Методы основаны на исследовании активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, участвующих в свертывании крови, фибринолизе и образовании кининов, по интенсивности и скорости расщепления специфически чувствительных к этим ферментам пептидов, при деградации которых освобождается красящий агент (β-нитроанилин).
Степень окраски реагирующей смеси определяется спектрофотометрически, и по ее интенсивности судят об активности соответствующих ферментов (факторов свертывания, калликреина, плазмина и др.), а по торможению процесса - об активности ингибиторов ферментов.
Так, например, действие гепарина и антитромбина III может быть оценено по ослаблению расщепления хромогенных субстратов фактором Xa или тромбином, а активность α 2 -антиплазмина - по ослаблению действия плазмина на соответствующий хромогенный субстрат. Хромогенные субстраты либо имеют цифровое обозначение (например, s-2222), либо именуются хромозинами с сокращенной приставкой, обозначающей тот фермент, к которому чувствителен этот субстрат (например, Chromozym PL - субстрат плазмина, Chromozym TH - субстрат тромбина, Chromozym PK - субстрат прекалликреина/калликреина и т. д.).
Хромогенные субстраты расширяют возможности исследования системы гемостаза, но пока недостаточно доступны для многих лабораторий. Некоторые исследования, выполненные с их помощью, не имеют преимуществ перед обычными коагуляционными тестами и дают совпадающие с ними результаты; в других случаях их использование упрощает и ускоряет исследование, делает его более точным; в третьих - эти методики имеют самостоятельное значение и не могут быть заменены коагуляционными тестами (например, определение прекалликреина).
Иммунологическое определение компонентов системы гемостаза выполняется методами:
При этом оценивается содержание в плазме крови антигена того или иного фактора свертывания (или его фрагментов), а не функциональная активность, которая может быть резко сниженной при нормальном содержании антигена в плазме. Такая ситуация характерна для всех тех случаев, когда в организме синтезируются аномальные (функционально неполноценные) факторы, сохраняющие свою антигенность, но лишенные способности участвовать в гемостазе.
Это позволяет разграничивать полное прекращение синтеза соответствующих факторов и образование их аномальных форм.
Вместе с тем ряд компонентов системы гемостаза может определяться только иммунологически.
В эту группу входят такие важные исследования, как определение следующих компонентов:
Поэтому иммунологическое исследование существенно дополняет функциональную оценку разных звеньев системы гемостаза.
Давно установлено, что яды многих змей содержат высокоактивные протеолитические ферменты, вызывающие свертывание крови и воздействующие на разные звенья коагуляционного каскада. Вследствие этого змеиные яды и выделенные из них коагулазы широко используются для распознавания нарушений гемостаза, количественного определения факторов свертывания, выявления и количественного определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и ряда других исследований.
Пробы со змеиными ядами часто намного упрощают и делают более оперативной диагностику нарушений гемостаза.
В таблице приведены данные о механизме действия ядов на свертывающую систему крови и возможностях диагностического использования каждого из них.
|
Гемокоагулирующие свойства змеиных ядов и их использование в диагностической практике |
|||
|
Наименование змей * и препаратов из их ядов |
Механизм действия на свертывающую систему |
Отличия от свойств естественных факторов свертывания |
Возможности диагностического применения |
|
Гюрза Vipera lebetina); лебетокс (гадюка Расселла; стипвен) |
Активатор фактора X (в присутствии кальция, фактора V и фосфолипида **) |
В отличие от тканевого тромбопластина не содержит фосфолипида и не компенсирует его дефицита. Не нуждается для реализации свертывания в факторе VII |
Определение фактора и тромбоцитов и его освобождения при агрегации; разграничение дефицита факторов VII и X; количественное определение фактора X |
|
Эфа многочешуйчатая (Echis multisgumatos) и эфа песчаная (Echis carinatus); экарин, эхитокс |
Активатор фактора II, образует атипичный тромбин-Ем |
В отличие от α-тромбина, тромбин-Ем не блокируется гепарином и антитромбином III, не активирует фактора XIII (сгустки лизируются в мочевине), коагулирует весь пул фибриногена и все растворимые комплексы фибрин-мономеров |
Выявление гиперкоагуляции, в том числе скрытой, при лечении гепарином; количественное определение всего фибриногена и РФМК с целью диагностики тромбинемии и ДВС- синдрома |
|
Щитомордник обыкновенный (Aghistrodon halus halus), а также многие гремучие змеи тропической Америки и Азии; анцистрон-Н1, рептилаза, ботропклотаза, кроталаза, анкрод и др. |
Свертывает фибриноген, отщепляя только пептиды А и образуя неполные мономеры фибрина (дес-А-фибрин) |
Не отщепляет пептиды В, не активирует фактор XIII и тромбоциты, не вызывает ретракцию сгустков, не блокируется гепарином, быстро лизирует сгустки |
Распознавание дисфибриногенемий; оценка роли гепарина в нарушении конечного этапа свертывания (в сопоставлении с тромбиновым временем) |
|
* Все указанные змеи обитают в Средней Азии (в скобках указаны другие виды со сходным механизмом действия и фирменные препараты из них; гадюка Расселла обитает в Индии, гадюка Дабойа - в Австралии. |
|||
|
** Аналог кефалина и тромбоцитарного фактора 3. |
|||
Эти возможности еще более расширяются при одновременном использовании нескольких ядов и простейших общих коагуляционных тестов. Так, например, одновременное применение коагуляционных проб с ядом гюрзы и эфы позволяет легко дифференцировать дефицит факторов VII, Х-V и II (в таблице ниже), а с дополнительной коррекцией профильтрованной нормальной плазмой (источник факторов V и II) -дефицит факторов X и V.
|
Коагуляционные тесты с применением различных ядов, дифференцирующие дефицит факторов протромбинового комплекса |
|||
|
Дефицитные факторы в исследуемой плазме крови |
Тесты |
||
|
с ядом гюрзы+кефалином |
с ядом эфы |
протромбиновый |
|
|
Примечание. (+) - нормализация свертывания; (-)-отсутствие нормализации свертывания. |
|||
Наиболее важное значение имеет определение активности основного физиологического антикоагулянта - антитромбина III, снижение которой может быть генетически обусловленным (первичная тромбофилия) либо вторичным вследствие интенсивного потребления (ДВС-синдром, массивные тромбозы) или ускоренного метаболизма (лечение гепарином, L-аспарагиназой, синтетическими контрацептивными средствами) и блокады иммунными комплексами, парапротеинами, фибронектином, белками острой фазы.
В любом случае снижение активности антитромбина III ниже 60-65 % поддерживает внутрисосудистое свертывание крови, делает менее выраженным антикоагулянтное действие гепарина. Вместе с тем очень часто между уровнем антитромбина III и снижением чувствительности к гепарину нет закономерного соответствия.
При этом обычно ослабление антикоагулянтного действия гепарина существенно преобладает над степенью снижения активности антитромбина III. Доказано, что при разных формах дефицита антитромбина III сродство его к гепарину может меняться в различной степени. Кроме того, разные фракции гепарина, соотношение которых в лекарственных средствах весьма изменчиво, также имеют различное сродство к антитромбину III. Поэтому практически важно исследовать как собственно активность антитромбина III, так и его способность превращаться под влиянием гепарина в быстродействующий антикоагулянт.
Антикоагулянтная активность антитромбина III определяется по способности исследуемой плазмы крови (разведенной - метод Копли-Винтерштейна или дефибринированной тепловой денатурацией при температуре 56 °С - методы Лолигера, Абильдгаарда и др.) инактивировать в течение определенного срока вводимый извне тромбин. Остаточная активность тромбина в такой плазме может определяться по ее свертывающей активности (на фибриногене, адсорбированной сульфатом бария плазме) либо по расщеплению хромогенного субстрата, чувствительного к тромбину или фактору Xa (поскольку антитромбин III инактивирует и этот фактор).
Гепарин-кофакторная активность содержащегося в плазме крови антитромбина III длительный период определялась с помощью теста толерантности плазмы к гепарину, который может считаться ориентировочным, поскольку дает очень большой разброс нормальных показателей и недостаточно воспроизводим.
Значительно более точны и воспро изводимы тесты, в которых исследуется влияние различных концентраций гепарина на тромбиновое время исследуемой плазмы, содержащей небольшое количество тромбоцитов. Сравнение проводится с удлинением тромбинового времени контрольной нормальной плазмы крови, к которой добавляются те же образцы гепарина.
Так, в тромбин-гепариновом тесте к исследуемой плазме крови добавляются такие количества гепарина, которые в контроле удлиняют тромбиновое время с 15 до 32-35 с (малая концентрация) и до 95-110 с (высокая концентрация гепарина). По этим данным рассчитываются индексы активности антитромбинов плазмы (ААП) и антикоагулянтного резерва плазмы (АРП).
Также широко используются сходные методики с оценкой степени инактивации тромбина как в коагуляционных тестах, так и на хромогенных субстратах.
Иммунологическое определение антигена антитромбина III позволяет дифференцировать различные виды тромбофилии:
Протеины C и S, тромбомодулин и α 2 -макроглобулин определяются иммуноэнзиматическими методами.
