Формула, химическое название:
нет данных.
Фармакологическая группа:
органотропные средства/ желудочно-кишечные средства/ противодиарейные средства; иммунотропные средства/ иммуномодуляторы/ другие иммуномодуляторы.
Фармакологическое действие:
антибактериальное широкого спектра, иммуностимулирующее, противодиарейное.
Действующее вещество бациллюс субтилис представляет собой лиофилизированную микробную массу живого антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3H, который был селектирован по признаку хромосомной резистентности к рифампицину из производственного штамма Bacillus subtilis 534. Одна доза лекарственного препарата содержит от одного до пяти миллиардов живых бактерий. Бациллюс субтилис обладают антагонистической активностью, выделяют антибактериальные вещества широкого спектра действия, которые подавляют рост условно патогенных и патогенных грибов, бактерий. При этом рост сапрофитов, включая нормальную микрофлору кишечника, не угнетается. За счет выделения Bacillus subtilis протеолитических ферментов (включая липазы, лизоцим, амилазы и другие) лекарственный препарат способствует расщеплению жиров, белков, клетчатки, углеводов, улучшает переваривание и усвоение пищи, способствует очищению ран, воспалительных очагов от некротизированных тканей. Бациллюс субтилис оказывают выраженное иммуностимулирующее действие, в том числе на переваривающую и поглотительную активность фагоцитирующих клеток крови. Бациллюс субтилис также обладают умеренным антиаллергическим действием.
Дисбактериоз кишечника различного происхождения (в том числе осложненный аллергодерматозом и пищевой аллергией); острые бактериальные кишечные инфекции (в том числе сальмонеллез, острая дизентерия и другие); бактериальный вагиноз; бактериальный вагинит; остеомиелит (при отсутствии крупных секвестров); хирургические инфекции мягких тканей; лечение и профилактика гнойно-септических осложнений, вызываемых условно патогенными и патогенными микроорганизмами при акушерско-гинекологических и хирургических операциях, в послеоперационном периоде.
Бациллюс субтилис применяется внутрь за 30 - 40 минут до еды, интравагинально, в виде орошений или аппликаций (на тампоне). При приеме внутрь бациллюс субтилис предварительно растворяют кипяченой остуженной водой. Дозировка, способ применения, длительность лечения устанавливаются индивидуально в зависимости от показаний и возраста пациента.
Лечение острых бактериальных кишечных инфекций, в том числе острой дизентерии, сальмонеллезов, продолжается в течение 7 - 10 суток.
Лечение дисбактериозов после перенесенных бактериальных инфекций или применения антибиотиков продолжается в течение 20 суток.
Лечение аллергодерматозов продолжается в течение 10 - 20 суток.
Лечение бактериального вагиноза, вагинита продолжается в течение 5 - 10 дней.
Профилактика гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде: в течение 5 дней до операции и 5 дней после операции или травмы.
Лечение и профилактики хирургической инфекции мягких тканей продолжается в течение 7 - 10 суток.
При необходимости курс лечения может быть повторен.
При применении бациллюс субтилис по показаниям в рекомендуемых дозах нежелательных реакций не выявлено. В случае развития побочных реакций они полностью проходят в течение суток при снижении дозы или отмене лекарственного препарата.
Действие бациллюс субтилис на женщин во время беременных не изучалось.
Разведенный порошок бациллюс субтилис не подлежит хранению.
С осторожностью назначают бациллюс субтилис при поливалентной лекарственной аллергии.
Бациллюс субтилис не используют при нарушении целостности упаковки, изменении физических свойств, наличии посторонних примесей, отсутствии маркировки.
Применение бациллюс субтилис не оказывает действия на выполнение потенциально опасных видов деятельности, которые требуют повышенной концентрации внимания и быстроты психомоторных реакций.
Гиперчувствительность (в том числе к вспомогательным компонентам лекарственного препарата).
Поливалентная лекарственная аллергия, детский возраст.
Действие бациллюс субтилис на женщин во время беременных не изучалось. Бациллюс субтилис может применяться по назначению лечащего врача во время грудного вскармливания.
Пищеварительная система:
диарея, боли в животе.
Прочие:
повышение температуры, озноб, кожная сыпь.
При совместном использовании бациллюс субтилис с антибиотиками возможно снижение терапевтической эффективности бациллюс субтилис.
При совместном использовании бациллюс субтилис с сульфаниламидами возможно снижение терапевтической эффективности бациллюс субтилис.
Допускается использование бациллюс субтилис совместно с другими лекарственными препаратами по согласованию с лечащим врачом.
480 руб. | 150 грн. | 7,5 долл. ", MOUSEOFF, FGCOLOR, "#FFFFCC",BGCOLOR, "#393939");" onMouseOut="return nd();"> Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут , круглосуточно, без выходных и праздников
Гатауллин Айрат Гафуанович. Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков: Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07 Москва, 2005 131 с. РГБ ОД, 61:05-3/1040
Введение
Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний 9
Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм 18
2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus 18
2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus 26
2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями 32
2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34
Глава 3. Объекты и методы исследований 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Методы исследований 43
3.2.1. Оборудование и методики 45
Глава 4. Характеристика выделенных штаммов 53
4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов 53
4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro 55
4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis 57
Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм 62
5.1. Изучение токсичности, токсигенности, вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo 62
5.2. Изучение влияние штамма B.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе 70
Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата 76
6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах 76
6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении 84
Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков . 94
Заключение 98
Выводы 107
Список литературы 108
Введение к работе
Актуальность проблемы
V На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые
данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .
В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .
Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .
* Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Нако-
- пленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики
бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней
]t среды, а также в организме человека и животных.
I Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая
вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам, послужили обоснованием использования бацилл в различных областях меди-
"4 цины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарствен-
ных средств США, присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием
5 для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .
Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .
Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .
Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .
Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .
На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию жи-
вых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .
В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил, споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген, энтерогермин и другие .
Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов, используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.
Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.
Цель работы:
Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм.
Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.
Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.
Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.
Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.
Научная новизна.
На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.
Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма B.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.
Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».
Практическая значимость.
Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. Л.А. Тарасевича под №277 и
Основные положения, выносимые на защиту:
Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид, антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.
Штамм В.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.
По технологическим характеристикам штамм В.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.
9 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний
Макроорганизм и его микрофлора являются единой экологической системой, которая начинает формироваться с момента рождения и находится в состоянии динамического равновесия, являясь естественным защитным механизмом от патологических воздействий. Представляя открытый биоценоз, микрофлора желудочно-кишечного тракта включает множество локальных микробиоценозов, занимающих тот или иной биотоп в организме человека или животного. Биотопы пищеварительного тракта располагаются в вертикальном (проксимодистальном) и горизонтальном направлениях. Помимо просвета, микрофлора кишечника в горизонтальном направлении может локализоваться в двух отделах слизистой оболочки: в слое гликопротеинов слизи, гликокаликсе, состоящем из гликопротеинов и гликолипидов над мембранами эпителиальных клеток .
Нормальную микрофлору здоровых людей и животных принято подразделять на индигеннную или резидентную, характерную для данного вида, и транзиторную. В пищеварительном тракте обнаружено около 500 видов микроорганизмов. Более 97% общего количества бактерий кишечника включает бесспоровые анаэробы - Bifidobacterium, Bacteroides, Lactobacillus, Eubacterium, содержание которых достигает Ю"^КОЕна 1 грамм фекалий. Число факультативных анаэробных микроорганизмов (Escherichia coli, Enterococcus spp., Staphylococcus spp. и др.) в сотни раз ниже .
Одной из важных сторон защитной функции бактерий нормальной микрофлоры является антагонистическая активность в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря биохимической активности представителей микроэкологической системы пищеварительного тракта, обеспечивающих продукцию субстанций с выраженной антагонистической активностью, попадающие извне патогенные микроорганизмы быстро элиминируют-
10 ся из кишечника. Это предотвращает развитие инфекционного процесса .
* Бактериальный антагонизм может осуществляться благодаря клеточному
контакту, в результате которого антибактериальные агенты передаются от штаммов-ингибиторов к штамму-мишени. В некоторых случаях колонизационная резистентность реализуется за счет сочетания антагонистического действия определенных представителей нормальной микрофлоры и (или) их метаболитов, а также появления специфических антител .
Fuller R. и Ленцнер А.А. с соав. доказали роль лактобацилл в поддержании микробного баланса благодаря продукции молочной кислоты и специфической адгезии к эпителию толстой кишки. Показана их антагонистическая активность в отношении патогенных бактерий, в частности, Salmonella typhimurium.
Бифидобактерии, продуцируя уксусную и молочную кислоты, препятствуют размножению гнилостной и патогенной микрофлоры, нормализуют пери-
^ стальтику, а также способствуют всасыванию кальция, железа, витамина D и
участвуют в процессах витаминообразования .
Vollaard E.J. et al. отметили, что кишечная палочка влияет на развитие и статус местной иммунной системы, связанной со слизистой оболочкой и обеспечивают защиту хозяина от инфекций, обусловленных энтеропатогенны-ми микроорганизмами. Она принимает участие в расщеплении белков и углеводов, метаболических превращениях холестерина, желчных кислот, жирных кислот .
У E.coli также обладают канцеролитическими свойствами. Карапетян А.О.
J выделила из кишечника здоровых лиц штаммы кишечной палочки и фекально-
го энтерококка, которые in vitro обладали способностью вызывать некроз рако-вых клеток. В то же время бактерии, выделенные от онкологических больных,
t таковыми свойствами не обладали. Этот микроб синтезирует в кишечнике 8 ви-
таминов: В] 5 В 2 , В 6 , В12, К, никотиновую и пантотеновую кислоты, биотин. Кроме того, E.coli создает необходимую анаэробную среду для строгих анаэро-
бов, поглощая Ог, диффундирующий из кровеносной системы через кишечную стенку в просвет. Наблюдения за естественной микробной колонизацией кишечника новорожденных и эксперименты по имплантации микробов в кишечник гнотобиологических животных обнаружили, что анаэробные бактерии обычно начинают колонизацию только после таких бактерий, как E.coli .
Важными регуляторами роста бактерий в кишечнике являются различные БАВ, экзоэнзимы и бактериоцины, например колицины, микроцины, лизоцим и др. Большинство авторов считают, что бактериоцины отличаются от "классических" антибиотиков более узким спектром антибактериального действия, поскольку специфически подавляют рост бактерий того же или филогенетически родственных видов. Например, патогенные энтеробактерии подавляют нормальную микрофлору и беспрепятственно распространяются в кишечнике. Возможно, колицины у представителей кишечной палочки, подавляя рост микроорганизмов, играют роль факторов естественной устойчивости макроорганизма .
Следует отметить, что колонизационная резистентность обеспечивается как представителями преобладающей анаэробной микрофлоры, так и факультативно аэробными бактериями, значение которых в 70-х годах прошлого века стало искусственно занижаться. Защитные свойства E.coli обусловлены не только антагонизмом на метаболическом уровне (бифидобактерии, бактероиды лактобациллы), но и могут быть опосредованными через макроорганизм . Однако интимная связь E.coli с ним, обеспечивающая "созревание" эпителия слизистой оболочки кишечника и формирование так называемого естественного иммунитета, вызывает и более "агрессивное" поведение микроба .
Нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнаталь-ном развитии макроорганизма .
Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают иммуно-
стимуляцию и иммуносупрессию, а также важные адъювантные и иммуноген-ные свойства. Известно, что бактериальные липополисахариды (ЛПС) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А - иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .
Таким образом, микрофлору пищеварительного тракта следует рассматривать как единую микроэкологическую систему, сформировавшуюся в ходе эволюции, которая выполняет и регулирует многочисленные функции организма хозяина, поддерживая колонизационную резистентность и тем самым, сохраняя его гомеостаз .
Французскими исследователями опровергнуто сложившееся мнение об индифферентности транзиторной части нормальной микрофлоры, как в отношении других бактерий, так и макроорганизма. Некоторые штаммы транзиторных эшерихий и бифидобактерий значительно снижали продукцию токсина С.difficile в кишечном тракте животных-гнотобионтов. Bacillus cereus - аэробный спорообразующий микроорганизм, выделенный из почвы, был использован как представитель транзиторной микрофлоры в препарате "Цереобиоген" (КНР) для лечения диарейных заболеваний у детей. Продолжительность его пребывания в кишечнике - 4 дня, но за это время он способствует размножению бифидофлоры и почти полному исчезновению клинических симптомов заболевания. Индийские ученые нашли, что микробы с транзиторным статусом, а не только представители резидентной микрофлоры, способны вырабатывать витамины и детоксицировать токсические продукты. Ими выделены виды рода Bacillus из тонкого отдела кишечника крыс, способные разрушать нейротокси-ны, гемагглютинины, присутствующие в бобах. Представители родов Bacillus и Klebsiella синтезируют витамины Вь В 2 , В^, никотиновую и фолиевую кислоты .
Различные заболевания инфекционной и неинфекционной природы, а также многие другие неблагоприятные факторы (изменение климатических ус-
13 ловий, лучевые воздействия, погрешности в режиме питания, ухудшение общего физиологического статуса, соматические расстройства, применение лекарственных средств, возрастные изменения организма и др.), действуя прямо или опосредованно, оказывают отрицательное влияние на сложную микроэкологическую систему макроорганизма в пользу активации условно патогенной микрофлоры .
Дисбиоз - это любое количественное или качественное изменение типичного для данного биотопа состава нормальной микрофлоры человека или животного, возникающее в результате воздействия различных факторов экзогенного и эндогенного характера, которое влечет за собой выраженные клинические проявления со стороны макроорганизма, либо являющееся следствием патологических процессов, развивающихся в нем. Факторы, ведущие к нарушениям микрофлоры, т.е. к дисбиозам, весьма многочисленны. Видимо поэтому почти 90% населения нашей страны, в той или иной мере, страдает дисбиозами. Они, как правило, сопряжены с нарушениями иммунной системы. Очевидно, изменения нормофлоры, состояние иммунного статуса и проявление болезни следует рассматривать в единстве, причем роль пускового механизма в каждом конкретном случае может принадлежать любому из этих компонентов триады. В одних случаях дисбиоз дает толчок развитию патологического процесса непосредственно, в других случаях он возникает через развитие иммунодефицита, в третьих - вызывает эти взаимосвязанные процессы .
Однако в последнее время дисбиоз кишечника все чаще считают следствием возникших иммунологических нарушений .
Клинические проявления дисбиозов многообразны: диспептические расстройства (запоры, диарея), нарушения обмена веществ, катаральновоспали-тельные заболевания (гастриты, дуодениты), гнойно-воспалительные заболевания и осложнения разной локализации, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, гепатиты, злокачественные новообразования, аллергия и т.д. .
Попытки применения только антимикробных препаратов для профилактики и терапии дисбиозов оказались малоэффективными, и в некоторых случаях усугубляли начавшийся процесс. Это определяет целесообразность применения средств корригирующей терапии, включающей препараты пробиотики, биодобавки, фитопрепараты для восстановления эубиоза .
С тех пор как было открыто свойство различных микробных культур, подавлять рост других микроорганизмов и особенно патогенных, виднейшие естествоиспытатели работали над проблемой практического использования явления антагонизма микробов (Л.Пастер, И.И.Мечников, Н.Ф.Гамалея и др.). Мысль о целесообразности регулирования состава кишечной микрофлоры при ее нарушениях, высказанная еще И.И.Мечниковым, привела к развитию нового направления в медицине - бактериальной терапии, созданию биологических препаратов-пробиотиков из живых бактерий, представителей нормальной микрофлоры человека .
Термин «пробиотики» предложен в 1974 г. Паркером для обозначения организмов и субстанций, обеспечивающих равновесие кишечной микрофлоры. Для отбора штаммов микроорганизмов в качестве препаратов - пробиотиков предложено несколько критериев: апатогенность, специфическое окрашивание по Граму, резистентность к кислотам и окислителям, колонизация и (или) адгезия к клеткам пищеварительного тракта, выделение противоколиформных факторов, резистентность к желчи, жизнеспособность и стабильность .
Пробиотики используют для коррекции микроэкологических нарушений при острых и хронических заболеваниях и дисфункциях желудочно-кишечного тракта, при нарушениях обмена, после антибактериальной, гормональной и лучевой терапии, в предоперационный и послеоперационный периоды, при неблагоприятных условиях и т.д. . Их биотерапевтический эффект может быть связан с прямым антагонистическим действием на патогенные и условно патогенные микробы, приводя к уменьшению их количества, с влиянием на их метаболизм, или же со стимуляцией иммунитета .
Препараты - пробиотики, изготавливают из живых антагонистически активных бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека: кишечной палочки (колибактерин), бифидобактерий (бифидумбактерин, бифидумбактерин форте, бифилиз), смеси кишечной палочки и бифидобактерий (бификол), лактобактерий (лактобактерин, ацилакт, аципол). В последние годы для лечения дисбиозов в лечебную практику были внедрены отечественные препараты, изготовленные на основе живых апатогенных антагонистически активных представителей рода Bacillus: споробактерин, бактис-порин, биоспорин .
При приеме per os, микроорганизмы, составляющие основу пробиотиков, большинство из которых являются к тому же представителями нормофлоры ЖКТ, заселяют его, способствуя нормализации биоценоза и, как следствие этого, восстановлению пищеварительной, обменной и защитной функций. Аналогичный механизм действия проявляется и при других способах аппликации (например, вагинальном) .
При приеме пробиотиков, как правило, не развиваются побочные реакции, и они не имеют противопоказаний к применению.
Большинство пробиотиков (бифидумбактерин, лактобактерин, аципол, ацилакт, бифилиз) могут быть применены уже с первых дней жизни, в том числе, и для недоношенных детей .
В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитывают, главным образом, следующие показатели: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению биомассы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Важен также спектр их антибиоти-корезистентности .
Особое внимание уделяется критериям безопасности используемых штаммов для здоровья человека .
По совокупности физиолого-биохимических свойств и факторов биологической активности наиболее перспективными для создания пробиотиков из
неиндигенной микрофлоры оказались бациллы, главным образом, относящиеся к B.subtilis, B.pumilus, B.polymyxa. Эти виды, стабильно выделяющиеся из разнообразных биотопов, в том числе, из организма и тканей теплокровных, насекомых и растений, не вызывали у последних патологических изменений.
Особенный интерес представляет вопрос о биологических свойствах споровых бактерий, изолируемых из организма человека или животных, с точки зрения познания механизмов их воздействия на макроорганизм. Кроме того, эта проблема важна для выявления новых резервов создания эффективных лечебно-профилактических препаратов, поскольку почти половина выделенных бацилл проявляет антагонистические свойства по отношению к различным патогенным и условно патогенным бактериям и грибам, при этом наибольшую активность проявляют штаммы Bacillus subtilis .
Установлена их способность синтезировать низкомолекулярные полипептидные антибиотики .
В качестве антагониста микобактерий туберкулеза предложен штамм B.subtilis МЖ-6, который в 96,2% случаев подавлял их рост in vitro. .
Обнаружено, что бактерии рода Bacillus способны оказывать антагонистическое воздействие по отношению к бактериям различных видов Klebsiella (336 культур) . Различные штаммы В. subtilis подавляли рост 57-83% культур К. ozaenae, 50-100% культур К. rhinoscleromatis, 64-95% - К. pneumoniae. Практически все тестируемые штаммы бактерий рода Klebsiella оказались чувствительны к тем или иным культурам В. subtilis, при этом значительное количество клебсиелл были одновременно чувствительны к действию нескольких культур сенной палочки.
При изучении антагонистической активности 150 свежевыделенных штаммов В. subtilis относительно К. rhinos cleromatis в опытах in vivo и in vitro, выявлен антагонизм у 114 культур по отношению к 5 тест - штаммам K.rhinoscleromatis. Из числа исследованных штаммов бацилл наибольшую активность проявляли культуры, выделенные из желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных .
17 Исходя из выявленных уникальных биологических свойств бактерий рода Bacillus, в последние десятилетия внимание исследователей привлекают проблемы создания препаратов на основе живых спорообразующих аэробных бактерий и изучения их влияния на макроорганизм.
На современном этапе можно считать установленным, что лечебный эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в том числе способностью продуцировать бактериоцины, подавляющие рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов, высокоактивные ферменты (протеазы, рибонуклеазы, трансаминазы и другие), а также субстанции, нейтрализующие бактериальные токсины. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма .
Изучение механизма лечебно-профилактического действия препаратов-пробиотиков на организм человека и животных показало, что бациллы способны проникать из желудочно-кишечного тракта в кровь, а оттуда в очаг поражения, сохраняя жизнеспособность. После перорального приема, уже в первые минуты через слизистые ротоглотки, пищевода и желудка примерно 0,1% от общего числа бактерий проникали в паренхиматозные органы. Бессимптомная транслокация микроорганизмов наблюдалась 6-8 часов после однократного приема препарата, чем определяло время воздействия препарата на макроорганизм. По данным двумерного электрофореза, в течение 0-10 мин после прорастания спор штамм В. subtilis 168 синтезировал 65 экзобелков, на 10-20 минуте -210 белков, а всего в ходе вегетативного роста клеток продуцировал 260 белков .
Существует предположение, что явление транслокации микроорганизмов в органы и ткани здоровых индивидуумов представляет собой эволюционно сформировавшийся динамический процесс, во многом определяющий участие общей нормальной микрофлоры в формировании защитных реакций макроорганизма .
В результате транслокации бацилл в кровь и органы теплокровных не происходит каких-либо патологических изменений. Этот процесс следует рас 27 сматривать в качестве одного из начальных звеньев естественного механизма стимулирования неспецифической резистентности в отношении всех микроорганизмов. При этом не исключаются возможные неблагоприятные последствия для макроорганизма в тех случаях, когда происходит проникновение патогенных микроорганизмов на фоне общего или локального ослабления защитных механизмов.
В свете понятия об экзогенном компоненте нормальной микрофлоры (поступающей с пищей, воздухом, водой) и связанной с ней транслокацией бацилл в органы и кровь, подтверждается целесообразность именно перорального введения пробиотиков, разработанных на основе экзогенных представителей микрофлоры. .
Антагонистическое действие бацилл осуществляется за счет продукции различных по природе биологически активных веществ: полипептидных антибиотиков, лизоцима, литических ферментов .
Высокая ферментативная активность бацилл имеет положительное значение с точки зрения обогащения желудочного секрета дополнительными, в том числе, парадигестативными ферментами. Показано, например, что культуры, входящие в состав Биоспорина или Бактерина-SL, проявляли выраженную пек-толитическую активность (0,1-0,2 ед/мл), обладали целлюлозолитическими свойствами, синтезировали комплекс протеолитических ферментов. Общая протеолитическая активность соответствовала 4,2-5,7 ед/мл, активность амилазы составляла 11-15 ед/мл, липазы - 70-127 мкмоль, олеиновой кислоты - 5-10 ед/мл . Культуральная жидкость штамма В. subtilis содержала следующие ферментативные активности: 1,3-1,4 глюканазу, 1,3-1,4 глюкозидазу, .
На модели пиелонефрита у мышей показано, что применение Биоспорина способствовало более быстрой элиминации S. aureus из почек, по сравнению с контрольными животными, за счет стимуляции макрофагов. Полученные данные позволили предположить, что биопрепараты из бацилл перспективны не только для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, но, возможно, и для лечения бактериальных инфекций, локализованных вне желудочно-кишечного тракта .
Для аккумуляции перитонеальных нейтрофилов животным внутрибрю шинно вводили 2 мл 1% раствора казеина; через 4-5 часов мышей забивали транслокацией шейных позвонков, используя премедикацию эфиром согласно правилам гуманного обращения с животными. Перитонеальную жидкость получали, промывая брюшную полость раствором Хенкса с гепарином во избежании агрегации нейтрофилов. Из полученной от 5 мышей перитонеальной жидкости одной группы животных формировали клеточный пул. Морфологическое изучение показало, что 70-85% клеточного содержимого составляли нейтрофи-лы. Жизнеспособность клеток превышала 95%. Клеточный пул центрифугировали при 1500 об/мин в течении 10 мин. Затем добавляли 300 мкл сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 3% уксусной кислоты, подсчитывали в камере Горяева количество выделенных нейтрофилов.
Методика постановки теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) спонтанного и стимулированного in vitro. Метод основан, на спо собности нейтрофилов поглощать нитросиний тетразолий и восстанавливать его в гранулы синего цвета нерастворимого диформазана (ДФ). Восстановление НСТ обеспечивается энергией и продуктами окислительно-восстановительных реакций "метаболического взрыва", сопровождающих процесс фагоцитоза, а также повышением метаболизма активированного нейтрофила. Различают спонтанный и индуцированный НСТ-тест. Результаты спонтанного теста ука зывают на количество активированных клеток в образцах. Результаты стимули г рованного теста дают представление о способности исследуемых нейтрофилов А к активации in vitro. Постановку реакции проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для иммунологических исследований. При анализе спонтанной активности в лунку вносили: 50 мкл 0,4% раствора НСТ, 50 мкл инкубационной среды (ИС-0,85% раствор NaCl с 20% содержанием сыворотки крови крупного рогатого скота), и 100 мкл клеточной суспензии. Для анализа индуцированной активно 50 сти в каждую лунку вносили: 50 мкл раствора НСТ, 50 мкл взвеси стимулятора (опсонизированный (о/з) и неопсонизированный (н/з) зимозан в соотношении 20 частиц/клетку) и 100 мкл клеточной суспензии. Каждый вариант реакции проводили в 2-х параллельных пробах. Контроль реагентов осуществляли заменой клеточной суспензии эквивалентным объемом ИС. Планшет инкубировали 20 мин при 37С. Для остановки реакции восстановления НСТ и осаждения клеток, содержащих ДФ, планшет центрифугировали 10 мин при 500g. Осажденные в лунках клетки фиксировали 96 % этиловым спиртом и однократно отмывали 0,85 % раствором NaCl. Разрушение клеток и растворение образовавшегося ДФ достигали добавлением в каждую лунку по 130 мкл ди-мексида и 70 мкл 2М КОН с последующей инкубацей - 20 мин при 60С. Содержимое лунок приобретало бирюзовое окрашивание, интенсивность которого зависила от количества экстрагированного ДФ. Результаты реакции регистрировали на спектрофотометре по разнице экстинкций на тестовой (630 нм) и референтной (490 нм) длин волн.
Оценку получаемых результатов проводили по уровням спонтанной активности нейтрофилов (сНСТ), индуцированной о/з активности нейтрофилов (о/зНСТ), индуцированной н/з активности нейтрофилов (н/зНСТ). Результаты тестов выражали в mOD (от англ. - Optical Density). Резервы функциональной активности клеток оценивали по коэффициентам активации (КАо и КАн), степень дискретности клеточной активности на различные стимулы определяли по коэффициенту опсо-низации (КО). (п=5).
Анализ хемилюминесценции фагоцитов выявляет образование клетками активных кислородных радикалов, включая супероксидный анион, синглетный кислород и гидроксильный радикал, участие в определенной степени миелопе-роксидазы фагоцитов, которая является показателем интенсивности дыхания клеток при фагоцитозе .
Ход анализа: В каждый флакон для сцинтилляционного счета добавляли 200 мкл lxlO 6 люминола, а затем вносили 200 мкл суспензии нейтрофилов, чтобы их конечная концентрация составила 0,5хЮ6на1 мл. Перемешивали со 51 держимое флаконов, помещали их в счетчик и проводили измерение хемилю-минесценции при 37 С в 0,1 минутные интервалы на протяжении 90-120 минут. Обычно через 45-60 минут после начала измерения заканчивалась адгезия клеток на стекло, интенсивность хемилюминесценции приближалась к исходному уровню. В этот период в те же флаконы вносили суспензию зимозана (оп-сонизированного и неопсонизированного) по 20 мкл (исходная суспензия 20 мг/мл после размораживания разводилась в10 раз, и это разведение вносили во флакон). Далее снова измеряли хемилюминесценцию, фиксируя число импульсов в минуту на протяжении 60 мин. Затем делали пересчет импульсов на 1 клетку и выражали хемилюминесценцию условно в имп/мин/клетка. (п=5).
Плазмидный анализ ДНК. Исходя из задач данного исследования, осуществляли стандартную процедуру, предназначенную для очистки плазмиднои ДНК с использованием щелочного лизиса . Биомассу (2 мл) суспендировали в 2 мл раствора следующего состава: 50 мМ глюкозы, 20 мМ Tris-HCl; 10 мМ EDTA; рН 8,0. К ней добавляли 20 мкл лизоцима (8 мг/мл), перемешивали и инкубировали при +4 -+8С 20 минут. После этого добавляли 4 мл лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1% SDS), перемешивали и продолжали инкубировать при той же температуре 5 минут. По истечении времени добавляли 3 мл нейтрализующего раствора (З М ацетат калия, рН 4,8), аккуратно перемешивали и инкубировали 30 минут при +4 - +8С. Далее пробирку центрифугировали (Backman J2-21, ротор JA-14) 30 минут при +4С со скоростью 10000 об/мин. Супернатант отбирали в пробирки и добавляли к нему 2,5 объема этанола. Инкубировали при температуре -70 С 10-15 минут и центрифугировали в течение 20 минут при температуре +4С (Backman J2-21, ротор JA-20) со скоростью 10000 об/мин. Осадок растворяли в 600 мкл воды, переносили в микроцентрифужные пробирки, добавляли 400 мкл 7,5 М Na-ацетата и инкубировали при -20 С в течение 30 минут. Затем центрифугировали 10 минут со скоростью 18000g при +4С. Осадок промывали 70% этанолом и затем высушивали на воздухе. Полученный препарат растворяли в 400 мкл ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0) и подвергали фенол-хлороформной экстракции . Добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ (1:1), насыщенной буферным раствором Tris-HCl, рН 8,0. Смесь интенсивно встряхивали на вортексе и центрифугировали 6 минут со скоростью 13000g при комнатной температуре. Су-пернатант переносили в чистые пробирки и добавляли равный объем смеси хлороформ/изоамиловый спирт (25:1). Пробирку встряхивали на вортексе и центрифугировали при 16000g и температуре +4 С в течении 2 минут. Супернатант переносили в чистые пробирки и осаждали ДНК из раствора добавлением 2,5 объема этанола и 1/10 объема ЗМ раствора ацетата натрия. Пробирку инкубировали при температуре -70 С 10-15 минут и затем центрифугировали 10 минут при 16000g и температуре +4 С. Супернатант удаляли и промывали осадок 70% спиртом (добавляя и сливая 200-500 мкл). Осадок высушивали на воздухе и растворяли в 200 мкл водного раствора рибонуклеазы А с концентрацией 5-10 мкг в мл и инкубировали 40 минут в термостате при температуре +37 С. Повторяли процедуру осаждения ДНК с помощью этанола и ацетата натрия. Осадок ДНК растворяли в 200 мкл ТЕ-буфера.
Промышленное получение препаратов на основе живых апатогенных микроорганизмов напрямую связано с подбором и оптимизацией питательной среды для выращивания.
Оптимальный выбор ингредиентов в среде способствует максимальному накоплению биомассы и проявлению антагонистических свойств штаммов, что служит показателем высокой продуктивности процесса культивирования .
Однако пробиотические штаммы имеют трофические особенности. Их следует учитывать в системе "штамм - питательная среда". Получение эффективных пробиотиков на основе штаммов В. subtilis остается актуальной задачей, для решения которой может быть использован принцип адекватности рецептуры питательной среды свойствам штамма. При изучении этого вопроса культивирование осуществляли на средах известного состава и разработанных нами средах на основе гидролизата соевой муки (СПАС-2, СПАС-4, СПАС-6) или на пептоне (ВК-2).
При оценке ростовых свойств сред на основе гидролизата соевой муки с пептоном (СПАС-2, СПАС-4, СПАС-6) и среде с пептоном (ВК-2) сравнение показателей культивирования проводили по отношению к средам, применяемым для выращивания штаммов В. subtilis - продуцентов БАВ (среды: № 5, № 9, КГ - картофельно-глицериновая).
Поскольку физиологические свойства культуры могли измениться в зависимости от добавления различных источников углеводов, целесообразно было сравнить результаты культивирования В. subtilis 1719 на средах исходного состава и с добавлением в качестве источника углеводов: глюкозы, мальтозы, сахарозы и лактозы.
Сравнение уровня оптической плотности (ОП) и скорости роста (и) кле-ток в культуральной жидкости в течение 18 ч выращивания на средах без Сахаров (рис. 6.1.) показало, что среды №5, СПАС-6 и картофельно-глицериновая среда обеспечивали рост штамма с показателем ОП, равным 0,24±0,01 (и=0,03 ч"1), 0,22±0,01 (1)=0,0334-1) и 0,3±0,01 (и=0,025 ч 1) соответственно. На средах СПАС-2, СПАС-4, №9 максимальная величина ОП составляла 0,42+0,03 (и=0,067 ч"1), 0,38±0,02 (1)=0,0541) и 0,58±0,03 (1)=0,037 ч"1) соответственно, а на среде ВК-2 - 0,85+0,6 (\ =0,068ч"). Время достижения максимальной концентрации биомассы на этих средах варьировало в пределах от 9±0,7 ч (СПАС-2) до18±1,Зч(КГГ).
Максимальный выход биомассы (ОП) выявлен на среде ВК-2, при скорости роста 0,068 ч"1, а наименьший на среде СПАС-6 и скорости роста 0,033 ч"1. Добавление к средам в качестве источника углеводов глюкозы (рис. 6.2.) вызывало подъем концентрации клеток В. subtilis 1719 почти вдвое, кроме сред №5, №9 и СПАС-6: на среде №9 отмечено недостоверное снижение значения ОП до 0,43±0,03 при практически той же скорости роста (0,035 ч"1), а на СПАС-6 величина ОП оставалась на прежнем уровне. Наиболее высокий выход биомассы выявлен на среде ВК-2, при этом ОП составила 1,0±0,09 (при 1)=0,066 ч"1) к 18 ч роста. Мальтоза (рис. 6.3.) оказалась оптимальным углеводом в составе сред №9 и №5. Величина ОП увеличилась на среде №9 до 0,695±0,025 (і)=0,058 ч"1) к 12 ч, а на среде №5 - 0,51±0,045 (и=0,022 ч"1) к 18 ч. На средах СПАС-4 и КГ выход биомассы снизился по сравнению с использованием глюкозы с 0,8±0,06 (1)=0,063 ч1) до 0,33±0,01 (1)=0,040 ч1) и с 0,62+0,04 (D=0,03 Ч"1) до 0,38±0,03(и=0,025 ч"1) соответственно. Рост культуры на среде ВК-2 имел тенденцию к снижению выхода биомассы, что отражалось в снижении величины ОП с 1,0±0,09 (1)=0,066 ч1) до 0,55±0,25 (D=0,046 ч"1). Лактоза, добавленная в среды (рис. 6.4.), обеспечивала рост В. subtilis 1719 на уровне ОП от 0,21±0,04 до 0,5±0,03, кроме ВК-2 - 0,83±0,05. Добавление к средам сахарозы (рис. 6.5.) способствовало высокому накоплению биомассы только на среде ВК-2, и ОП достигала значения 1,1+0,06 (и=0,063 ч"1) к 17 ч культивирования. Без дополнительного внесения углеводов оптимальной средой для накопления биомассы оказалась только среда ВК-2. Она обеспечивала наибольшее накопление бактериальных клеток при добавлении глюкозы, лактозы и сахарозы. Максимальный показатель выхода биомассы В. subtilis 1719 получен на среде ВК-2 с добавлением глюкозы (ОП - 1,0±0,09) к 18+0,15 ч культивирования или сахарозы (ОП - 1,1+0,06) к 17+1,0 ч культивирования. Установлено, что состав питательных сред не оказывал какого-либо влияния на антагонистические свойства штамма.
Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .
Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности, у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах. Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид. Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью. Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.
В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.
Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: про 101 дуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов, подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз, рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.
Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью. Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .
В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.
В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.
Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы В.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам, т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .
Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .
Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.
Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .
Бациллюс субтилис является одним из представителей вида аэробных , положительных по Граму. В связи с тем, что для получения накопительных культур данного микроорганизма используют сенный экстракт, второе название бациллюса – Сенная палочка. впервые представил знаменитый немецкий естествоиспытатель Христиан Готфрид Эренберг в 1835 году, однако в его трактовке этот микроорганизм носил название Vibrio subtilis. А свое современное название Bacillus subtilis он получил уже в 1872 году. На сегодняшний день это один из наиболее известных и тщательно изученных представителей рода бацилл.
Для Бациллюса характерна форма прямой палочки, которая имеет прозрачную структуру. Приблизительная толщина Bacillus subtilis составляет 0,7 микрометра. А в длину такая бацилла может достигать от двух до восьми микрометров.
Размножаются сенные палочки, как и другие бацилл, делением. В отдельных случаях после того, как произошло поперечное деление, бактерии продолжают оставаться соединенными в тоненькие нити.
Среди самых важных биохимических свойств, присущих Бациллюсу субтилис, следует выделить способность закисления среды, а также продуцирования антибиотиков. Именно благодаря этим своим свойствам Сенная палочка из рода бацилл способна уменьшать воздействие различных условно-патогенных, а также патогенных микроорганизмов. Bacillus subtilis – это антагонист для:
К другим характерным свойствам Бациллюса относятся:
Для бактерии Bacillus subtilis характерно жгутикование перитрихиального типа, а также центральное расположение спор, имеющих форму овала, и размер, который не превышает размер клетки. Что касается колоний Бациллюса, они бывают белыми или розовыми, им присущ волнистый край, а также сухая и бархатистая структура, покрытая мелкими морщинками.
Для эффективного могут требоваться среды нескольких видов:
Под понятием мясопептонного агара принято подразумевать универсальную , которая может иметь как плотную, так и полужидкую текстуру. В составе данной среды присутствуют такие компоненты, как мясная вода, поваренная соль, а также размельченный и тщательно промытый агар. Для его стерилизации в автоклаве необходима температура не менее 120 ºC, а процесс этот должен длиться приблизительно двадцать-тридцать минут. После завершения стерилизации готовая среда будет остывать естественным путем, приобретая более плотную текстуру.
Максимально благоприятное развитие Сенной палочки гарантируется при уровне температуры воздуха от +5 до +45 ºC.
Относительно патогенности Бациллюса существует несколько мнений. Так, в соответствии с официально действующими на территории Российской Федерации санитарными правилами и нормами, Bacillus subtilis принадлежит к роду условно-патогенных бактерий.
Jpg" alt="Девушка смотрит в микроскоп" width="300" height="188" srcset="" data-srcset="https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/07/Vyjavlenie-bakterij-300x188..jpg 640w" sizes="(max-width: 300px) 100vw, 300px"> Однако Большая Советская Энциклопедия, а также авторитетные зарубежные источники твердо настаивают на безопасности Бациллюса субтилис, утверждая, что данный микроорганизм является абсолютно не патогенным. В результате научных исследований была доказана безопасность данных бактерий из рода бацилл как для людей, так и для животных. Таким образом, Управление по контролю качества лекарственных и продовольственных средств в Соединенных Штатах Америки справедливо присвоило Bacillus subtilis статус абсолютно безопасных организмов.
Однако, несмотря на данный факт, ни в коем случае не допускается присутствие Сенной палочки в разнообразных консервах, в частности, рыбных, мясных и растительных. Всегда следует иметь в виду, что если по каким-либо причинам в консервах остались споры, сохранившие свою жизнеспособность, это значит, что при хранении данного продукта при температуре, превышающей +20 ºC, размножение возбудителей будет неизбежным. Поэтому, для того чтобы обезопасить консервы от содержания Бациллюса, необходимо тщательно соблюдать все технологии и нормативы приготовления продуктов данного типа. Как правило, о присутствии Bacillus subtilis в консервах сигнализирует наличие характерного сероватого налета. Кроме того, с запахом и консистенцией консервов происходят определенные неблагоприятные изменения.
Data-lazy-type="image" data-src="https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/08/bacilljus3-300x236.jpg" alt="бактисубтил" width="300" height="236" srcset="" data-srcset="https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/08/bacilljus3-300x236..jpg 382w" sizes="(max-width: 300px) 100vw, 300px"> Благодаря биохимическим свойствам достаточно широко распространено применение Бациллюса в производстве медицинских препаратов. Так, Bacillus subtilis из рода бацилл, согласно фармакологическому указателю, принадлежит к таким категориям, как:
Основная функция таких препаратов заключается в регулировании нормальной деятельности кишечной флоры и ее равновесия. В результате поддерживания ее на нормальном уровне полностью устраняются любые проявления дисбактериоза.
Препараты Бациллюса назначают при таких состояниях, как:
Все свои полезные свойства препараты Bacillus subtilis идеально сохраняют при соблюдении правил хранения. Оптимальная температура воздуха в данном случае составляет 25 ºC. Кроме того, очень важно обращать внимание и на срок годности, указанный на упаковке. Препарат Сенной палочки имеет вид лекарственной суспензии, представленной во флаконах объемом 2, 5 и 10 миллилитров.
Следует помнить, что применение данной бактерии из рода бацилл также имеет определенные противопоказания. Главным образом это повышенная чувствительность к составным компонентам препаратов.
К самым популярным медицинским препаратам, созданным на основе Бациллюса в качестве действующего вещества, принадлежат:
Data-lazy-type="image" data-src="https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/08/bacilljus1.jpg" alt="биоспорин" width="300" height="185">
Еще одна бактерия, являющаяся положительной по Граму и принадлежащая к роду бацилл, Турингиенсис (Bacillus thuringiensis), обладает способностью во время споруляции образовывать включения, которые имеют похожую на кристалл структуру. В своем составе она содержит дельта-эндотоксины – вещества, принадлежащие к категории энтомоцидных белков. Форма такого «кристалла» может быть различной – кубической, бипирамидальной или округлой. Особые свойства данной бактерии позволяют использовать ее в сфере биологической защиты растений.
Для Бациллюса характерны особые свойства, позволяющие широко его применять в медицинской сфере. К главным из рода бацилл относятся:
Jpg" alt="сенная палочка" width="300" height="225" srcset="" data-srcset="https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/08/bacilljus4-300x225..jpg 285w, https://probakterii.ru/wp-content/uploads/2015/08/bacilljus4.jpg 640w" sizes="(max-width: 300px) 100vw, 300px">
Бациллюс субтилис или cенная палочка (лат. Bacillus subtilis ) - вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus ). Bacillus subtilis - один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов.
Название сенная палочка происходит из-за того, что ранее Bacillus subtilis изолировался исключительно из сенных отваров . Bacillus subtilis имеет вид бесцветной прямой палочки, размером примерно 0,7 мкм в толщину и 2-8 мкм в длину. Bacillus subtilis может размножаться делением и спорами. Иногда отдельные Bacillus subtilis , после поперечного деления, остаются соединенными в нити.
Bacillus subtilis (сенная палочка), благодаря продуцируемым антибиотикам и способности закислять среду обитания, является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла , протей , стафилококки , стрептококки , дрожжевые грибки; продуцируют ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей; синтезируют аминокислоты, витамины и иммунноактивные факторы. Некоторые штаммы Bacillus subtilis являются продуцентами гиалуроновой кислоты .
Bacillus subtilis может быть причиной пищевых отравлений человека (код по МКБ-10 A05.4).
Бациллюс субтилис
(Bacillus subtilis
) - действующее вещество некоторых лекарственных препаратов. В данном контексте под термином «бациллюс субтилис» понимается определенный штамм (штаммы) бактерий вида Bacillus subtilis
. По фармакологическому указателю бациллюс субтилис относится к группам «Противодиарейные средства» и «Другие иммуномодуляторы». По АТХ бациллюс субтилис имеет код «A07FA Антидиарейные микроорганизмы». Показания к применению бациллюс субтилис:
селектированного по признаку хромосомной устойчивости к антибиотику - римфапицину из производственного штамма Bacillus subtilis
534. Российскими предприятиями 48 ЦНИИ Минобороны России ФГУ, г. Екатеринбург, ЗАО «Биофарма» и несколькими украинскими предприятиями производится лекарственный препарат Биоспорин , содержащий смесь Bacillus subtilis
штамм 2335 (также называемый Bacillus subtilis
3) и Bacillus licheniformis
2336 (также называемый Bacillus licheniformis
31) в пропорции 3:1.В России также зарегистрированы (были зарегистрированы) лекарства, в которых основным действующим веществом являлись Bacillus subtilis: (штамм 534), Бактиспорин (штамм N 3H).
Препараты на основе сенной палочки Bacillus subtilis
(Споробактерин, Биоспорин, Бактиспорин) и сходного микроорганизма Bacillus cereus
(Бактисубтил) обладают антимикробной активностью и могут использоваться при бактериальных инфекциях при невозможности приема антибиотиков или для селективной деконтаминации тонкой кишки при синдроме избыточного бактериального роста. Споры этих бактерий, превращаясь в толстой кишке в активные формы, вырабатывают в процессе жизнедеятельности кислые метаболиты - органические кислоты. При этом рН в толстой кишке сдвигается в кислую сторону и подавляется рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Белоусова E.А., Златкина А.Р.).
В состав лекарственного препарата Энзимтал , имеющего разрешение на применение на территории Украины (позже отозванном), имеется грибковая амилаза - амилолитический фермент, получаемый из грибов Aspergillus oryzae и непатогенных бактериальных культур Bacillus subtilis (Кирик Д.Л., Полякова И.Ф.).
БАД Бактистатин содержит метаболиты бесклеточной культуральной жидкости Bacillus subtilis
штамм 3 (содержащей в том числе витамин Е), носитель цеолит, ферментированный гидролизат соевой муки, антислеживающий агент стеарат кальция (или аэросил), ингредиенты капсулы (желатин медицинский, титана диоксид, индиготин). Бактистатин рекомендуется разными авторами, в частности, для коррекции синдрома избыточного бактериального роста лёгкой степени (Логинов В.А.), как дополнительного средства: при синдроме кишечной недостаточности (Левченко С.А.), Н.pylori-
ассоциированном гастрите (Грищенко Е.Б.) и других.
Штаммы Bacillus subtilis используются в ряде лекарств и продуктов для ветеринарии и сельского хозяйства. В частности, пробиотик «Субтилис» (жидкая форма «Субтилис-Ж» и порошок «Субтилис-С»), включающий в свой состав собой микробную массу живых спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis применяется в животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве для профилактики и лечение заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, дисбактериоза, легочных инфекций, увеличения продуктивности, получения здорового потомства, подавления роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов (
Определение
: Бактерии.
Класс
: бациллы.
Семейство
: бацилиас.
Род
: бацилус.
Вид:
Bacillus subtilis, тип биномиального имени "сенная палочка
" утверждён Эренбергом в 1835, подтверждён Кохом в 1872 .
Сенная палочка
, является представителем грамположительных, и каталазо-положительных бацилл, встречается обычно в земле. В отличие от ряда других известных видов, она исторически была классифицирована как облигатный аэроб, хотя в 1998 году исследование показало, что это не совсем правильно.
Само наименование "сенная палочка" происходит от того, что её легко и быстро можно обнаружить из закисшего настоя сена.
Сама бактерия похожа на прозрачную прямую бациллу, габаритом приблизительно 0,7 микрон в поперечнике и длинной 2-8 микрон. Сама бактерия способна плодиться дроблением и споровыми формациями. Эпизодически единичные бактерии этого вида, остаются объединенными тонкими нитями.
Популярна эта сенная бактерия потому, что вырабатывает "антибиотические соединения". И также известна благодаря выделяемым лёгким органическим кислотам. Считается врагом болезнетворных и условноболезнетворных микробов, типа стрептококков, сальмонелл, протеев почвенных, золотистого и обычного стафилококка, кандиды. Она продуцирует ферменты, устраняющие клеточные стенки грибницы для разрушения тканей грибков; производит витаминные комплексы, растительные аминокислоты, иммунноактивные факторы.
Сенная палочка не считается патогенной или токсичной и не является причиной смертельных заболеваний. Она присутствует везде – в воздухе, почве, растениях, а также в массе компоста. Сенная бацилла один из главных микроорганизмов присутствующих в верхних слоях почвы.
Однако, что интересно, это основная среда обитания сенных бактерий в желудках жвачных и в тонком кишечнике человека. Исследование 2009 года на плотность спор, обнаруженных в почве (~ 106 спор на грамм), и того, что найдено в фекалиях человека (~ 104 спор) на грамм. И как можно заметить, что почва просто служит этаким подобием резервуара, а кишки и желудки это то, где она живёт и размножается.
Сенная палочка , как сельскохозяйственный и защитный инструмент.Подавляет болезнетворные микроорганизмы в почве путем конкурентного ингибирования и генерации натуральных антибиотических соединений. Сенная бактерия производит изобилие полезных соединений и ферментов, что наиболее важно, она производит токсический элемент под названием субтилизин из класса липопептидных антибиотиков, под названием «iturins». «Iturins» имеет истинно фунгицидную активность в отношении многих патогенов, таких как оидиум, корневые гнили, фитофтора, фузариоз, чёрная плесень, сосудистый бактериоз, мукоровые гнили, серая гниль, антракноз, бактериальный ожог, синегнойная палочка, бактериальный рак, а также против нематод.
Сенная Палочка Bacillus subtilis
Антибиотик, выделяемый из этой бактерии вне конкуренции у других микроорганизмов, так как убивает их путем прямого уничтожения или снижения скорости их роста. Таким путем сенная палочка занимает пространство на корнях растений, оставляя меньше площади для оккупации возбудителями заболеваний.
Бациллы сенные потребляют экссудаты симбионтов, чем лишают возбудителей болезни основного источника питания, тем самым подавляя их способность выживать и размножаться. И это позволяет защитить растение от патогенных микроорганизмов.
Ещё эта бактерия производит естественное поверхностно-активное вещество, которое обладает способностью к био-разложению углеводородов нефти.
Она также стимулирует экспрессию гена естественных защитных механизмов у растений и животных.
А штамм QST 713 (продается как QST 713 или Серенада) используют в качестве агента биологической борьбы, как фунгицид из природы. На основании этого штамма данной бактерии вырабатывают ряд лекарств, нужных для охраны овощных, ягодных,плодовых, и прочих растений от грибковых заболеваний. На данный момент одним из самых действенных био-фунгицидов считаются препараты, содержащие споры этой бациллы.
