100 р бонус за первый заказ
Выберите тип работы Дипломная работа Курсовая работа Реферат Магистерская диссертация Отчёт по практике Статья Доклад Рецензия Контрольная работа Монография Решение задач Бизнес-план Ответы на вопросы Творческая работа Эссе Чертёж Сочинения Перевод Презентации Набор текста Другое Повышение уникальности текста Кандидатская диссертация Лабораторная работа Помощь on-line
Узнать цену
Стафилококкозы в стационарах 40-60%
В настоящее время род Staphylococcus уже к семейству Micrococcaceae не относится (с начала 90-х годов). Семейства Micrococcaceae не существует (т.к. генетического родства между его составляющими нет). Объединялись лишь по признаку грамположительных аэробных и факультативно-анаэробных кокков, делящихся в нескольких плоскостях.
Micrococcus - генетически родственник актиномицетов.
Staphylococcus – генетически родственник клостридий.
При исследованиях на фузобактерии, правотеллы, бактероиды (строгие анаэробы) на бескислородной среде если не применять среду с антибиотиками (аминогликозиды), то стафилококки (да и энтеробактерии) забьют всё!!!
Метод истощающего посева
Стафилококки – факультативные анаэробы. Micrococcus – строгие аэробы
Дифференциация – тест с аэробным и анаэробным расщеплением глюкозы. Все Staphylococcus глюкоза+ без газа под вазелиновым маслом. Micrococcus – нет.
Staphylococcus – более 30 видов, с подвидами – 44. Дифференцируются они по 33 тестам.
Граница галотолерантности – среда с 7,5 и более % NaCl.
Micrococcus – на 6,5% ещё растут, а выше – только Staphylococcus. (ЖСА – 10% NaCl). Некоторые виды 15% NaCl.
Молочно-солевой агар –растут микрококки, т.к. там NaCl ниже.
У буржуев – среда Чапмена - маннитолово-солевой агар (1% маннита)– 7,5% NaCl. Маннитол=маннит, как глицерол=глицерин
Целенаправленное выделение Staphylococcus (например при санитарно-бактериологических исследованиях). Зона пожелтения за счёт образования кислоты. Как его альтернатива у нас – ЖСА.
Т.е. если выделяем кокки на среда с ≥ 7,5 NaCl то они всегда глюкозо+, т.к. это Staphylococcus, а Micrococcus не растут
Морфология микрококков чуть отличается от стафилококков – и колонии и клетки крупнее , чем у стафилококков.
У каждого человека на коже 7-10 видов микрококков (а всего около 15 видов), М. luteus – преобладает - крупные желтые колонии на неингибиторных средах(старое название – воздушные сарцины, истинные сарцины в аэробных условиях не растут!!!). Равномерно красятся по Граму. В виде кучек, тетрад, пакетов. Другие – белые, бесцветные и т.п. M.livi – эмалево-белые. M.cristi - красные колонии.
Стафилококк по Граму окрашивается неравномерно (ситцевость окраски). Гроздья – чаще дает S. aureus, а так кучки, тетрады, пакеты и т.п. Стафилококки с жидкой стеды – одиночные, пары, кучки.
На средах без желтка пигмент S. aureus не образуется и колонии бывают серыми.
Каротиноиды в воде не растворяются и среда вокруг колонии никогда не окрашивается у Staphylococcus и Micrococcus.
Ангелина Гесс – в середине 19 века ввела агар в среды
Micrococcus тоже УПМФ – сепсис. In vitro чувствителен ко всему. У животных пенициллин – 5 единиц на инъекцию – на уровне изобретения пенициллина – лечит сепсис. Но in vivo лечить очень трудно. Сепсис у больных с сердечным шунтированием. Если попадают в аппарат искусственного кровообращения.
Planococcus – нас не интересуют – в морской воде и человеку не опасны
Стоматококки – 1 вид. Хорошо растут на КА (на КА вообще вырастает что угодно), но на солевых средах они не растут. Особенного клинического значения не имеют. УПМФ. Очень редко вызывают гингивиты и стоматиты (но чаще эти заболевания вызывают анаэробы и вирусы).
S. aureus subsp. aureus
S. aureus subsp. anaerobius - в аэробных условиях не растет (строгий анаэроб)
Среди стафилококков нет сапрофитов – все условно-патогенные . Более 86 нозологических форм заболеваний.
S. aureus и S.epidermidis – по 45 % всех стафилококкозов. Пищевые отравления - только S. aureus (S.epidermidis – может вызывать лишь у грудных детей). Энтеротоксины продуцируют только S. aureus.
У каждого человека 10-12 видов стафилококков живет на коже.
Передние отделы носа – главный биотоп. Там больше всего на единицу площади.
S. epidermidis также может, наряду с S. aureus вызывать вспышки ВБИ.
У новорожденных: конъюнктивиты S. epidermidis раньше в Москве в 70-х годах; госпитальные пневмонии S. epidermidis сейчас.
Плазмиды передаются со скоростью около 2 часов (2 часа стафилококк побыл на коже другого человека и получил новую плазмиду).
Носительство .
В родовспомогательных учреждениях плановое исследование на стафилококк не проводится (только при вспышках) – 345 приказ. У хирургического профиля – 720 приказ до сих пор (нигде в мире не проводится). Количество стафилококковых инфекций одинаково и у «буржуев» и у нас, независимо от санации.
По тест-системам можно дифференцировать до 12-15 видов стафилококков и несколько видов микрококков.
691 приказ – по роддомам отменен. Новый 345 приказ не имеет бактериологической части, поэтому по бактериологии все до сих пор ориентируются по 691 приказу.
Плановое обследование на носительство стафилококка отменено.
Коагулазоположительных стафилококков сейчас 5 видов.
|
коагулаза |
мальтоза |
хлопьеобразование |
Гемолиз на КА с кровью человека |
||||
|
Ч/з сутки |
Почти 100% |
||||||
|
± менее 50% |
|||||||
|
Ч/з ночь |
S. aureus не дает коагулазу очень редко – при первичных посевах от больного с массивной антибиотикотерапией. Поэтому пересеваем на косяк и потом снова ставим плазму. Если нет – это не S. aureus.
Пигмент на средах с повышенным содержанием белка и свет (ЖСА, сывороточная среда с белком)
Среди коагулазоотрицательных стафилококков некоторые тоже могут образовывать пигмент. S промагенес – на любой среде образует желтый пигмент
Ацетоин=ацетилметилкарбинол – реакция VP (Фогес-Проскауэра)
Среда Гиса с глюкозой полужидкая. При посеве с солевой среды всегда глюкозоположительны, по крайней мере, в верхней части столбика.
Окончательный отрицательный ответ по полужидкой среде Гиса с глюкозой выдаётся только на 5-е сутки.
Если газ – предполагаем, что микст или вообще не стафилококк.
Полужидкая среда с маннитом исключена в 1974 году – окончательный отрицательный ответ только на 5-е сутки. Ставится только на чашке – ответ наутро.
Плотная среда с глицерином (1%) (может заменяться любым сахаром и спиртом). Жидкие и полужидкие среды для дифференциации внутри родов Staphylococcus и Micrococcus не используются никогда. Индикатор –бромтимолсиний, рН – нейтральный; или бромкрезолкрасный, бромтимолкрасный. Сеем бляшками – до 10 культур на чашку. Радиальной полосой – до 6 культур на чашку. Вокруг стафилококка – пожелтение. Микрококки глицерин не утилизируют.
S. aurecularis на тест-системах он на 95-99% даёт аналогичность S. aureus и только по реакции плазмокоагуляции его можно отличить.
Коагулазоотрицательные стафилококки
При определённых условиях могут давать пигмент.
У стафилококков по 1-2 тестам дифференциацию до вида провести невозможно.
Растет в плазме в виде хлопьев Маннит+ всего 6-7 видов.
|
коагулаза |
трегалоза |
|||||
|
Более 20% штаммов |
||||||
|
5-10% штаммов |
||||||
|
95-100% штаммов |
||||||
|
5% штаммов |
||||||
|
S. saprophiticus |
5% штаммов |
У 100% S. aureus гемолитическая активность.
S. saprophiticus встречается очень редко. Циститы и уретриты у женщин молодого возраста – чувствителен к антибиотикам и химиопрепаратам
Коагулазонегативные не могут стать коагулазоположительными.
S. epidermidis никогда не бывает коагулазоположительным, что бы не было написано в 720 приказе
Неспоровая клетка может прожить 10-12 дней.
Щелочная фосфатаза характерна только для S. epidermidis.
Щелочная фосфатаза – паранитрофенолфосфат или фенолфталеинфосфат из тестов на ЩФ в биохимии– 50 мг на 100 мл агара до 20 штаммов на чашку.
Паранитрофенолфосфат → паранитрофенол (желтый) и окраска среды в лимонно-желтый цвет.
Фенолфталеинфосфат → фенолфталеин (бесцветный). Защелачиваем 3-10% р-ром аммиака (капаем на крышку чашки) Колонии малиновые.
Можно купить 10% р-р фенолфталеинфосфата. Хранится в холодильнике годами. 0,5 мл р-ра на 100 мл агара.
S. epidermidis природно чувствительны к новобиоцину.
Лецитовителаза (желточный фактор) – в международной классификации не используется, только у нас.
20-25% S. epidermidis лецитиназопозитивные.
На 80% S. aureus – человеческого происхождения – дают лецитовителазу. Лецитиназонегативные S. aureus – от животных.
Другие стафилококки тоже могут давать. Т. е. Если лецитовителаза+, то это на 80% S. aureus, на 20% другие стафилококки.
Чашки ЖСА на просвет – зона просветления (протеаза) – нам она не важна.
Помутнение – преобладают липазы – также не важны.
Буржуйские кровяные среды – из эритроцитов барана. Считалось, что человеческие штаммы S. aureus продуцируют только α-гемотоксин, но сейчас есть и β-гемотоксин. Это можно разобрать только на эритроцитах барана.
β-гемотоксин даёт зону неполного гемолиза через сутки, а если затем поставить до конца рабочего дня в холодильник – то зона полностью просветлеет.
S. aureus продуцирует 2 фермента
1) термолабильная ДНКаза (нуклеаза) – она есть у всех стафилококков и у большинства других микробов.
2) Термостабильная ДНКаза (нуклеаза) – есть только у S. aureus. Не разрушеется при кипячении и даже кратковременном автоклавировании.
И по нашим приказам определяется только термолабильная ДНКаза (смысла нет).
В прогретой пище (при скрытии факта ПТИ) стафилококк разрушается, а токсины остаются. По наличию термостабильной ДНКазы можно определить, был ли S. aureus.
По приказам высокополимеризированную ДНК 1-2 мг на 1 мл среды (рН=8,0). Посев на чашку бляшками (или уколом). 24 часа. Проявляем, заливая чашку 3N HCl, образуется преципитат ДНК с HCl и где ДНКаза сработала – видим зону просветления. У S. aureus радиус её 10-12 мм, у S. epidermidis её радиус 4-5 мм. Вокруг лунки с убитой культурой S. aureus – 7-8 мм.
S. epidermidis образует только термолабильную ДНКазу, S. aureus – обе ДНКазы – зона больше.
Широко распространенные стафилококковые инфекции, начавшись с заболевания верхних дыхательных путей, могут сражать весь организм. В связи с преимущественным поражением тех или иных органов материалом для исследования при стафилококковых инфекциях могут быть мокрота, гной, кровь, полоскательные носоглоточные смывы, отделяемое мочеполового тракта, пищевые продукты (преимущественно молочные и кондитерские изделия), смывы с инфицированных поверхностей, рвотные массы, эксудаты, отобранные в строгом соответствии с правилами аспектики.
При анализе материала используются микроскопический, бактериологический (выделение чистой культуры микробов и их идентификация) и биологический методы.
I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД
Микроскопический метод имеет самостоятельное значение лишь при асептической работе с материалами, которые у здорового человека стерильны (например, кровь, спинномозговая жидкость). Обнаружение стафилококков при этом имеет самостоятельное диагностическое значение. В остальных случаях микроскопический метод применяется как предварительный, ориентировочный. При его использовании необходимо обращать внимание на количество микроорганизмов в каждом поле зрения (при стафилококковых заболеваниях патогенный возбудитель может вытеснить остальную микрофлору и обнаруживаться в мазках в громадных количествах), размеры гроздей (при высокой патогенности стафилококк усиленно делится, особи не успевают разойтись и дают большие грозди-скопления), величину отдельных особей (патогенные стафилококки в большинстве своем очень мелкие).
II. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Бактериологический метод - выделение чистой культуры возбудителей и их идентификация.
Стафилококки относятся к числу весьма распространенных микроорганизмов. Они обнаруживаются и у здорового человека. Поэтому для диагностики заболевания, установления его стафилококковой природы очень важно доказать патогенность выделенных бактерий. Решение диагностической задачи при этом тесно связано с выяснением вопросов эпидемиологии, лечения и профилактики данной инфекции. На этом основании бактериологический метод складывается из нескольких этапов и направлений.
Все перечисленные этапы исследования отражены в схеме:
Выделение чистой культуры возбудителя должно осуществляется с учетом его культуральных особенностей галофильности (хорошее развитие в присутствии избыточного содержания поваренной соли при одновременном угнетении прочей микрофлоры), высокой потребности в белках и углеводах. Это достигается путем применения элективных питательных сред, выполняющих одновременно и функции дифференциально-диагностических.
СОСТАВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ СТАФИЛОКОККОВ
При выполнении анализа необходимо учитывать следующие возможности отклонения от типичной характеристики стафилококков.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСНОВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ
Основными показателями вирулентности стафилококков являются гемолитическая активность, выработка фермента плазмокоагулазы и некротоксичность.
При оценке степени патогенности культур широко используются тесты Гросса, согласно которым все стафилококки можно разделить на три группы. В первую группу безусловно патогенных стафилококков включают бактерии, обладающие (резкой гемолизирующей активностью, свертывающие цитратную плазму в течение 1-2 часов и располагающие выраженными некротизирующими свойствами. Вторую группу условно-патогенных или умеренно-патогенных стафилококков составляют штампы, дающие незначительный гемолиз-на агаре с 5% кроличьей или бараньей крови, свертывающие плазму позже 6 часов, а при внутрикожном введении кролику вызывающие красноту и инфильтрат. К третьей группе непатогенных стафилококков причисляют культуры, не гемолизирующие эритроциты, не коагулирующие плазму и не обладающие некротизирующими свойствами.
Таким образом, оценка вирулентности выделенного стафилококка основана на комплексном испытании трех показателей болезнетворного действия.
Вместе с тем имеются официальные указания на то, что при выделении стафилококков из молочно-кислых продуктов, особенно длительно хранившихся в холодильнике, могут исчезать отдельные, признаки патогенности при сохранении способности к токсинообраэованию в целом. Следовательно, стафилококки, у которых выпадает один из признаков патогенности, должны считаться патогенными (Инструктивное письмо института имени Эрисмана от 1967 года).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕМОТОКСИНА выполняется путем прямого посева культуры на кровяной МПА, содержащий 5-10% дефибринированной кроличьей или бараньей крови. Добавление крови человека нежелательно, так как стафилококки, выделяющие альфа-гемолизин, человеческие эритроциты не разрушают и, следовательно, суждение о патогенности данного штамма, выделеннного от больного человека, окажется недостоверным.
Иногда в результате изменчивости стафилококков, а также при длительном хранении культур в неблагоприятных условиях гемолитическая активность последних ослабляется или вовсе исчезает. Для восстановления гемолизирующей способности бактерий целесообразно добавлять в среду, на которой испытывается гемотоксичность, редуцирующую смесь из расчета 0,015 г на каждые 10 мл среды. Смесь состоит из одной части Na 2 SO 3 (сульфат натрия) и двух частей Na HSO 3 (бисульфат натрия). Восстанавливающую смесь хранят в темноте и добавляют к расплавленной среде ex tempore. С целыо сохранения гемолитичности экзотоксина у стафилококковой культуры рекомендуют также к 100 мл фильтрата культуры добавлять 100 мл насыщенного раствора Na 2 S 2 0 3 (восстановитель) и 250 мл насыщенного раствора гидрохинона (стабилизатор). В. И. Иоффе предлагает для восстановления гемолитической активности добавлять на каждые 0,4 мл лишь 0,1 мл 1% раствора сульфата натрия Na 2 SO 3 .
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМОКОАГУЛАЗЫ осуществляется путем посева культуры стафилококка в узкую пробирку с 0,5 мл 5% кроличьей или человеческой цитратной плазмы. Посевы помещают в термостат на 6-10 часов с регистрацией результатов через 1, 2, 3 и 6 часов. Плазма человеческой крови дает непостоянные результаты, а донорская плазма с глюкозой и мертиолятом вообще не пригодна. В случае же невозможности замены человеческой плазмы ее используют только после 10-кратного разведения физиологическим раствором.
Наряду с классическим методом определения плазмокоагулазы применяется также реакция плазмокоагуляции на стекле или ускоренный "слид-тест". Этот методический прием основан на способности коагулазоактивных стафилококков склеиваться плазмой крови и коагулировать ее. Коагулазо-отрицательные штаммы таким свойством не обладают. Для выполнения реакции берут каплю воды, суспендируют в ней испытуемую культуру, после чего добавляют одну каплю разведенной плазмы крови кролика или человека. Через 15-60 секунд образуется плазменный сгусток. Более поздняя (позже минуты) реакция считается сомнительной, а реакция, наступившая через 3 минуты,- отрицательной.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКРОТОКСИНА производится путем внутрикожного введения кролику 0,2 мл взвеси 2 млрд, суточной агаровой культуры стафилококка в физиологическом растворе. Наблюдение за животным ведется в течение 24-48 часов. Как положительная реакция расценивается лишь инфильтрат с желтоватым центром, темным ободком и ярко-красной каймой по периферии с последующими явлениями некроза.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПАТОГЕННОСТИ СТАФИЛОКОККОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТА ГИАЛУРОНИДАЗЫ осуществляется путем испытания культуры на субстрате, содержащем гиалуроновую кислоту. В качестве последней используются экстракт из пупочных канатиков новорожденного. Для этого пупочные канатики в количестве 3-5 штук, собранные в 0,5% раствор карболовой кислоты, тщательно отмывают от крови дистиллированной водой, очищают от сосудов, мелко нарезают и дважды пропускают через мясорубку. Затем полученный фарш взвешивают и заливают полуторным объемом дистиллированной воды, после чего в течение 30 минут оставляют при комнатной температуре, периодически встряхивая. Далее всю эту массу выливают в воронку с 2-3 слоями стерильной марли, отфильтровывают, отжимают, бросают на минуту в кипящую воду, количественно соответствующую первоначальному весу измельченных канатиков. Дают вскипеть. Жидкость быстро фильтруют через двойной слой стерильной марли в стерильные пробирки и в каждую из них для консервирован,ия субстрата добавляют несколько капель хлороформа. Затем пробирки закрывают ватной пробкой и ставит на холод для сохранения. Эстракт остается при этих условиях почти неизменным в течение нескольких месяцев.
Проба на гиалуронидазу выполняется в два этапа. Первым из них является определение рабочей дозы гиалуроновой кислоты (опыт ставят лишь 1 раз после приготовления экстракта и повторяют 1-2 раза в месяц при длительном хранении), вторым - выявление фермента гиалуронидазы.
| Схема определения рабочей дозы и титра гиалуроновой кислоты | ||||||
| Реагенты | Пробирки и их содержимое в мл | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Экстрат гиалуроновой кислоты | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 |
| Диетил. вода или физ. раствор | 0,9 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 |
| В термостат при +37 °C на 15 мин. | ||||||
| 15% раствор укс. кислоты (индикатор) | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к | 2 к |
| Результат (образование сгустка | - | + | + | + + | + + + | + + + + |
Пробирки помещают в термостат при 37 °C на 15 минут, после чего добавляют 2-3 капли 15% раствора уксусной кислоты, осторожно встряхивают и по образованию сгустка читают результаты. Титром гиалуроновой кислоты считается ее минимальное количество, которое при действии уксусной кислоты дает четкий сгусток. В данном примере титр гиалуронового субстрата 0,2 мл. Это же количество принимается за рабочую дозу.
Схемы определения гиалуронидазной активности культур см ниже.
Все содержимое пробирок перемешивают, ставят сначала в термостат на 15 минут, затем на холод - на 5 минут и добавляют 2-3 капли 15% уксусной кислоты. Наличие гиалуронидазы у бактерий регистрируется по отсутствию сгустка в опытной пробе. В контрольной пробирке должен проявиться хороший сгусток за счет присутствия здесь цельной гиалуроновой кислоты.
Для более точного количественного определения гиалуронидазной активности испытуемой культуры проба ставится по следующей развернутой схеме.
| Схема определения гиалуронидазной активности культур | ||
| Компоненты | Пробирки | |
| 1 | 2 | |
| (основная проба) | контроль гиалуронидазовой кислоты | |
| Экстракт гиалуроновой кислоты в рабочей дозе (в мл) | 0,2 мл | 0,2 мл |
| Фильтрат - фермент или 2 млрд. взвесь микробов в физиологическом растворе (в мл.) | 0,3 мл | - |
| Дистил. вода или физ. раствор (в мл.) | 0,2 | 0,5 мл |
| В термостат при +37 °C на 15-30 мин, затем на холод на 5 минут для прекращения действия фермента | ||
| 15% раствор уксусной кислоты | 2 капли | 2 капли |
| Схема количественного определения гиалуронидазной активности | ||||||
| Компоненты в мл | Пробирки | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| контроль гиалуроновой к-ты | ||||||
| Экстрат гиалуроновой кислоты в раб. дозе (в мл) | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Взвесь бактерий 2 млрд. (в мл) | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | - |
| Дистил. вода или физ. раствор в мл | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 |
| Выдержать в термостате, на холоде добавить индикатор 15% уксусную кислоту | ||||||
| Результат (образование сгустка) | - | - | - | + | + | + |
Титр гиалуронидазной активнсти культуры в данном примере 0,3 мл.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИБРИНОКИНАЗЫ основано на способности стафилококка лизировать фибринные сгустки свежей крови. Для испытания берут 0,5 мл бульонной суточной культуры стафилококков, вносят в 0,2 мл свежей человеческой плазмы или крови с 0,8 мл физиологического раствора. Затем осторожно перемешивают, предварительно добавив 0,5 мл 0,25% раствора хлористого калыция. Контролем в данной реакции служит пробирка со всеми теми же компонентами, но без бактерий. Пробирки помещаются в термостат при 37 °C. В течение первых 15 минут наступает свертывание. C этого момента следят за ходом растворения образовавшегося сгустка. Обычно патогенные культуры обеспечивают полный фибринолизис в течение 24 часов.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КУЛЬТУР НА СРЕДЕ ЧЕПМЕННА. Приготовление среды: к 1 л 3,5% МПА добавляют 3,3 мл 0,1% водного растзора генцианвиолета или кристал-виолета. Готовую среду разливают в чашки. После застывания она имеет серовато-сиреневый цвет. Патогенные стафилококки дают на ней фиолетовые или оранжевые колонии, непатогенные - белые или сиреневые.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ ПО ОТНОШЕНИЮ к манниту осуществляется на жидкой среде Гиоса, содержащей 0,5% многоатомного спирта - маннита. Патогенные стафилококки маннит разрушают через 36 часов, непатогенные значительно позже. Этот признак весьма неустойчив и самостоятельным показателем патогенности не является.
УСКОРЕННЫЙ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ
И ИНДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВ ПО ПЕТРУ ДАНИЛА
Метод основан на комплексном использовании обычного кровяного МПА с бараньими эритроцитами и среды с маннитом, хлористым натрием и теллуритом калия, рецепт которой разработан Петру Данила.
СРЕДА ПЕТРУ ДАНИЛА ИМЕЕТ СЛЕДУЮЩИЙ СОСТАВ: дистиллированная вода-100 мл; пептон - 0,5 г; хлористый натрий -10 г; маннит или лактоза-0,5 г; теллурит калия-0,5 г; бромтимоблау - 0,004 г.
Приготовление среды: в теплой воде растворяют пептон, соль, добавляют 2 мл раствора бромтимолбау (0,1 г на 3,2 мл N/20 раствора едкого натрия и 50 мл дистиллированной воды), стерилизуют при +120 °C в течение 15 минут. После охлаждения добавляют 5 мл 10% водного раствора маннита или лактозы, простерилизованного кипячением и 5 мл 1 % водного раствора теллурита натрия, простерилизованнаго в автоклаве. Среда темно-зеленая, pH -7,6. При синем цвете в нее добавляется несколько капель 10% соляной кислоты. Среду разливают по 1-2 мл в пробирки.
Пожелтение среды Петру Данила через 24 часа после посева культуры и гемолиз вокруг колоний стафилококка свидетельствуют о выделении патогенных бактерий.
УСКОРЕННАЯ КОМПЛЕКСНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННОГО СТАФИЛОКОККА ПО ПЕТРУ ДАНИЛА
Дифференциация патогенных стафилококков производится в одной пробирке. Метод основан на способности патогенных стафилококков агглютинироваться в присутствии человеческой плазмы, коагулировать ее, а также вызывать при этом агглютинацию гомологичных эритроцитов. Для выполнения пробы к 1 мл нитратной человеческой плазмы добавляют 10 мл физиологического раствора и 0,05 мл осевшей под плазмой эритроцитарной массы. Пробирку встряхивают и 0,5 мл смеси переливают в другую пробирку. Сюда же вносят как можно больше культуры стафилококка, которую осторожно растирают на стенке пробирки близко от жидкого субстрата, слегка прикасаясь к его поверхности. Растирание продолжают до получения гомогенной взвеси. Патогенный стафилококк агглютинируется плазмой, и гомогенизации не происходит, непатогенный - образует равномерную гомогенную массу.
Патогенные стафилококки при растирании культуры в плазменном субстрате образуют зернистую негомогенную взвесь, а после инкубирования в термостате вызывают гемагглютинацию эритроцитов и плазмокоагуляцию. Непатогенные штампы образуют при этом равномерную мутную взвесь, а коагуляции плазмы и склеивания эритроцитов не наступает.
| Таб. 1. Типы фагов | |
| Группа | Бактериофаги |
| I | 29, 52, 52А, 79, 80 |
| II | 3А, 3В, 36, 55, 71 |
| III | 6, 7, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А |
| IV | 42Д |
| V | 81 и 187 |
ФАГОТИПИРОВАНИЕ СТАФИЛОКОККОВ
В различных местностях циркулируют разные фаготипы стафилококков. Поэтому определение их у стафилококковых культур имеет большое значение для выяснения возможного источника инфекции и путей ее распространения.
Среди плазмокоагулирующих стафилококков по номенклатуре Международного Комитета по фаготипированию различают 22 типа фагов (таб.1):
Определение лизируемости стафилококков названными бактериофагами выполняется следующим образом.
ПОДГОТОВКА КУЛЬТУР К ФАГОТИПИРОВАНИЮ
ФАГОТИПИРОВАНИЕ
Положительным считается результат, степень лизиса при котором определяют не менее как на 2 плюса. В этом случае зона лизиса составляет около 50% площади в месте нанесения бактериофага.
Во многих случаях культуры стафилококков лизируются не одним, а несколькими фагами, образуя своеобразую фагомозаику из стерильных пятен. Стафилококки, обнаруживающие одну и ту же мозаику или отличающиеся на 1 фаг, считаются идентичными.
БИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД
Биологический метод диагностики применяется только при подозрении на пищевую интоксикацию, вызванную энтеротропными стафилококками, выделяющими энтеротоксин. Принцип его сводится к скармливанию остатков пищи, подозрительной на инфицированность стафилококком, выделенной культуры, промывных вод. Лучшей биологической моделью при этом являются 1,5-2-месячные котята (для исследования культуры) и взрослые кошки (при выявлении энтеротоксина). При капельных стафилококковых инфекциих этот метод не применяется.
Источник : Мотавкина Н.С., Пьянова Р.Е. Микробиологическая диагностика некоторых капельных инфекций и токсоплазмоза. Методическая разработка для студентов. ВГМУ, 1973
Staphylococcus aureus bacteria are pathogens to both man and other mammals. They are gram positive bacteria that are small round in shape (cocci) and occur as clusters appearing like a bunch of grapes on electron microscopy.
Staphylococcus were earlier divided into two groups on the basis of their ability to clot blood plasma. The coagulase-positive staphylococci constitute the most pathogenic species S aureus . The coagulase-negative staphylococci (CNS) are now known to comprise over 30 other species. It is the CNS that is present as harmless bacteria on skin but some of these may cause infections as well.
These days coagulase reaction is no longer used to classify S.aureus. This is because coagulase is a marker for S aureus but there is no direct evidence that it is a virulence factor. Nevertheless, the term is still in widespread use among clinical microbiologists.
S. aureus expresses certain proteins and polysaccharides on its surface. This is correlated with virulence. Virulence is the effect of many factors expressed during infection. The bacteria also produce certain toxins. In the body antibodies neutralize staphylococcal toxins and enzymes.
At least 30 species of staphylococci have been recognized by biochemical analysis. This is especially so with DNA-DNA hybridization. Of these, 11 are found in humans as harmless bacteria on skin, in the nose and throat. These can cause disease and infections in certain situations.
These bacteria are Gram-positive cocci about 0.5 - 1.0 μm in diameter. They are present as grape like clusters. They may also occur in pairs and occasionally in short chains. The clusters arise because staphylococci divide in two planes. This clustering helps to distinguish staphylococci from streptococci, which usually grow in chains.
Growing on solid medium colonies of S. aureus these appear as golden clumps.
This test helps to distinguish between streptococci (that is catalase-negative) and staphylococci (which are catalase positive). On an agar slant or broth culture of the bacteria several drops of 3% hydrogen peroxide are applied. Catalase-positive cultures bubble at once. This cannot be done on blood agar since blood itself will produce bubbles.
After sample from the lesions are taken, they can be stained with Gram stain. S. Aureus is Gram positive. The organism from the clinical specimen from blood culture or pus is then streaked over solid media such as blood agar, tryptic soy agar or heart infusion agar. If the specimen is suspected to be contaminated it is plated on mannitol salt agar containing 7.5% sodium chloride.
Another test is production of thermostable deoxyribonuclease. S aureus can be confirmed by testing colonies for agglutination with latex particles coated with immunoglobulin G and fibrinogen which bind protein A and the clumping factor, respectively.
Microscopically cells occur singly and in pairs, short chains, and grape-like clusters. The cell wall of the bacteria contains teichoic acid. Ribitol teichoic acid (Polysaccharide A) is present in Staphylococcus aureus . Protein A uniformly coats surface of S. aureus and is usually oxidase negative.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus - факультативно анаэробные грамположительные кокки, неподвижные, каталазо- и коагулазоположительные. Некоторые штаммы S. aureus продуцируют стафилококковые энтеротоксины (SEs), вызывающие пищевые отравления. Стафилококки присутствуют в воздухе, пыли, сточных водах, воде, молоке, продуктах питания, а также на оборудовании пищевых производств, на различных поверхностях в окружающей среде, на кожных покровах людей и животных. Именно люди и животные являются основным резервуаром инфекции. Стафилококки присутствуют в полостях носа, и горле, а также на волосах и кожном покрове по крайней мере у 50% здоровых людей. Staphylococcus aureus способен расти в широком диапазоне температур от 7 до 48,5°С (оптимум 30 - 37°С); рН 4,2 - 9,3 (оптимум рН 7,0-7,5) и при высокой концентрации хлорида натрия (до 15% NaCl). Такие свойства позволяют бактериям заселять самые разнообразные продукты. Продукты, наиболее часто являющиеся причиной стафилококковых пищевых отравлений - это мясо и мясопродукты, мясо птицы, яйца, салаты (содержащие яйцо, тунец, курицу, картофель, макароны), кондитерские изделия (например, пирожки с кремом, шоколадные эклеры), начинка сэндвичей, молоко и молочные продукты. Таким образом, продукты, которые в процессе приготовления значительное время обрабатыватся вручную и впоследствии хранятся в тепле, могут быть реальным источником стафилококковых пищевых отравлений.
Интоксикация при стафилококковой инфекции
Причиной болезни являются продуцируемые Staphylococcus aureus токсины, поэтому заболевание характеризуется очень коротким инкубационным периодом - обычно от 0,5 до 6 часов. Восприимчивость больного к токсинам определяется состоянием больного, концентрацией токсина и количеством съеденного зараженного продукта. Инфекционная доза может быть менее 1,0 мкг, что соответствует примерно 100.000 КОЕ/г продукта. Наиболее распространенными симптомами заболевания являются тошнота, рвота, отвращение к пищи, спазмы в животе и диарея. Период реабилитации занимает, как правило, 1-3 дня, но в тяжелых случаях полное восстановление может занять больше времени. Болезнь не передается окружающим, больным необходимо принимать большое количества жидкости.
Патогенность, масштабы заболевания
Коагулозоположитепльные стафилококки - это грамположительные каталазоположительные микроорганизмы, которые образуют типичные колонии на селективно-диагностической питательной среде, дающие положительную реакцию на коагулазу (S. аureus; S. aureus spp. anaerobius) или специфическую для кроличьей плазмы реакцию на агаре с кроличьей плазмой и фибриногеном при определении стандартным методом. Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк) - это коагулозоположительные стафилококки, образующие ацетоин и ферментирующие мальтозу в аэробных условиях в процессе определения этих биохимических тестов стандартным методом.
Согласно недавним исследованиям в развитых странах из всех известных инфекций чаще всего к смерти приводит одна из самых известных, «обыкновенных» бактерий - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк; все штаммы стафилококков, продуцирующие коагулазу, называют золотистыми ). Этот условно-патогенный микроорганизм выделяют у 15-30% здоровых людей, причем носительство у большинства из них ограничено несколькими месяцами. При дефиците иммунитета у больного возбудитель является причиной многочисленных, опасных для жизни зооантропонозных инфекций. Самая распространенная токсическая стафилококковая болезнь - это пищевое отравление. Многие штаммы золотистого стафилококка продуцируют энтеротоксин. Этот яд вызывает диарею, рвоту, боли и спазмы в животе. Согласно проведенного в Новой Зеландии исследования 8,6% детей, госпитализированных с сепсисом, вызванным Staphylococcus aureus, умирают. Дерматовенерологи многих стран обеспокоены увеличением количества стафилококковых инфекций и смертельных случаев из-за стафилококка. Бактерии вызывают порчу пищевых продуктов, включая и так называемые «непортящиеся» продукты. Размножаясь, например, в твердом сыре и салями, бактерии выделяют токсины. Именно они являются наиболее частой причиной серьезных пищевых отравлений. При кулинарной обработке стафилококк гибнет, но его термостабильные токсины не разрушаются. Стафилококки являются причиной множества болезней человека, включая сердечные (эндокардит и перикардит), опорно-двигательного аппарата (остеомиелит и инфекционный артрит). На коже и в мягких тканях стафилококк вызывает так называемый синдром шелушащейся кожи и целлюлиты , являющиеся наиболее частыми инфекционными болезнями кожи. По данным ВОЗ золотистый стафилококк возглавляет список бактерий, которыми наиболее часто заражаются в медицинских учреждениях. Высок риск инфицирования стафилококком при использовании внутривенных катетеров и других медицинских устройств, контактирующих с внутренней средой организма. Фактором риска является и искусственная вентиляция легких. Инфицирование стафилококком может также происходить при нарушении обычных правил гигиены в больницах. Всего на S. аureus приходится около 30% всех «госпитальных инфекций». Стафилококки, выжившие в условиях постоянного применения дезинфицирующих средств и использования антибиотиков - серьезнейший фактор риска для персонала, основа госпитальной инфекции.
Таксономия
Стафилококки - род шаровидных неподвижных аспорогенных грамположительных хемоорганотрофных факультативно-анаэробных или аэробных бактерий из семейства Micrococcaceae. В роду Staphylococcus выделяют около 30 видов, при этом 14 обнаружены на коже и слизистой человека, включая S. aureus , S. epidermidis, S. saprophyticus . Для видовой идентификации используют, в основном, 3 теста: продукцию плазмокоагулазы, анаэробную ферментацию маннита и глюкозы. Антигенная структура бактерии сложная, видоспецифичными антигенами являются тейховые кислоты.
Морфология бактерий и колоний
Бактериальные клетки диаметром 0,5-1,5 мкм делятся в нескольких плоскостях несимметрично, образуя скопления, напоминающие гроздья винограда. Встречаются одиночные клетки, пары и тетрады. Клеточная стенка содержит пептидогликан и глицеринтейховую кислоту. Стафилококки формируют гладкие колонии, окрашенные каротиноидами в желтый или оранжевый цвета. Однако пигментирование не является видовым признаком. При росте на желточно-солевом агаре образуются мутные круглые ровные колонии кремового, желтого или оранжевого цвета. При культивировании в жидких средах бактерии вызывают их равномерное помутнение, а затем образование рыхлого осадка, превращающегося в тягучую массу.
Физиолого-биохимическая характеристика
Стафилококки - факультативные анаэробы, но быстро и обильно растут при наличии кислорода. Хемоорганотрофы с окислительным и ферментатиывным метболизмом. Биохимичесчки очень активны. Продуцируют каталазу, на среде с глюкозой в анаэробных условиях большинство штаммов образуют ацетоин (положительная реакция Фогеса-Проскауэра). Выделяют аммиак при росте на аргениновом бульоне, восстанавливают нитраты до нитритов или молекулярного азота, активно гидролизуют белки, в аэробных условиях расщепляют многие углеводы до уксусной кислоты и углекислого газа. Родовым признаком является ферментация глюкозы в анаэробных условиях, что отличает стафилококки от микрокков. Бактерии растут на основных средах при 37°С (оптимум 35-40°С), но могут расти и в более широком интервале температур (6,5÷46°С). Оптимум роста отмечен при рН 7,0-7,5, но возможен рост в диапазоне рН=4,2÷9,3. Хорошо выдерживают повышенное осмотическое давление, поэтому элективным субстратом для них служат среды с высокой концентрацией хлорида натрия - желточно-солевой или молочно-солевой агар. Стафилококки хорошо переносят высушивание, сохраняя при этом вирулентность; погибают при прямом воздействии солнечного света в течение 10-12 часов. Довольно устойчивы к нагреванию: при 70-80 о С погибают за 20-30 мин, при 150 о С - за 10 мин; сухой жар убивает их за 2 часа. Бактерии устойчивы к действию низких температур, повторное замораживание и оттаивание их не убивает. Менее устойчивы стафилококки к действию дезинфектантов (перекиси водорода и др.), но резистентны к воздействию чистого этанола. При выращивании в аэробных условиях бактерии нуждаются в аминокислотах и витаминах, в анаэробных - требуют дополнительно урацил и дополнительные источники углерода. На кровяном агаре могут образовывать несколько видов гемолизинов - веществ, поражающих эритроциты, лейкоциты и другие клетки. Продуцируют также фибринолизин, фосфатазу, бактериоцины; отдельные штаммы продуцируют коагулазу, ДНК-азу, H 2 S и энтеротоксины (до 10 видов, характеризующихся летальным, гемолитическим или некротическим действием). Ферментируют некоторые углеводы с выделением кислоты без газа. Устойчивы к лизоциму, чувствительны к различным антибиотикам. Патогенные для человека виды обладают одним из 4 факторов токсичности, таким как: 1) экзотоксин, 2) энтеротоксин, 3) лейкоцидин, 4) коагулаза (фермент патогенности). Кросс-резистентность к антибиотикам контролируется R-плазмидой. Другим прокариотамэтот фактор устойчивостипередается трансдукцией.
Источники и факторы передачи инфекции
Стафилококки - условно патогенные микробы. Являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных - густо колонизируют различные биотопы организма (кожу, слизистую носа и зева ротовой полости, брюшную полость и подмышечные области). Стафилококки внедряются в организм через кожные покровы и слизистые оболочки воздушно-капельным и воздушно-пылевым путем. Механизм инфицирования обычно связан с переносом возбудителя из участков колонизации на травматизированную поверхность (например, кожные покровы). Существенную роль играют также тесные контакты с носителями и лицами, страдающими стафилококковыми поражениями. Стафилококк устойчив ко многим внешним воздействиям, поэтому обнаруживается во внешней среде - воздухе (пыль), почве, на предметах обихода. Источники и факторы передачи стафилококковой инфекции множественные. Основные источники - больные со стертыми формами стафилококковой инфекции или носители, реже - заболевшие животные, например, (при пищевых стафилококковых отравлениях и энтероколитах) больные маститом коровы. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляет медицинский персонал, который может являться носителем госпитальных штаммов стафилококка. Для стафилококковой инфекции характерна множественность механизмов, путей и факторов передачи. Бактерии могут передаваться контактно через нестерильный медицинский инструмент, руки медперсонала, алиментарно с молочными продуктами и кондитерскими изделиями, аэрогенно и парентерально (при инъекциях).
 |
Патогенез
Восприимчивость к стафилококкам очень низкая у лиц с нормальным иммунным статусом и повышенная у иммунокомпромиссных хозяев. Очень часто стафилококковая инфекция развивается на фоне вторичных иммунодефицитов. Факторами патогенности возбудителя является микрокапсула, компоненты клеточной стенки, ферменты агрессии и токсины. Микрокапсула защищает бактерии от фагоцитоза, способствует адгезии микробов и их распространению по тканям. При выращивании in vitro она не образуется. Компоненты клеточной стенки стимулируют развитие воспалительных реакций и нейтрализуют иммуноглобулины, обездвиживают фагоциты. Тейховые кислоты запускают каскад комплимента (компонента иммунологических реакций) по альтернативному пути. Фермент агрессии стафилококков коагулаза существует в трех антигенных формах и вызывает свертывание сыворотки крови. При целом ряде патологических состояний организма стафилококки покидают свои обычные биотопы, преодолевают тканевые барьеры и привносятся кровотоком во внутреннюю стерильную среду организма. Там они вызывают типовую патологическую реакцию - воспаление. Оно проявляется в форме гнойно-воспалительных процессов различной локализации и степени тяжести, вплоть до сепсиса и септикопиемии. Стафилококки являются этиологическим фактором заболеваний, подавляющее большинство которых носят гнойно-воспалительный характер. Бактерии способны поражать практически любые ткани организма. Вызываемые S. aureus инфекции разнообразны и включают более 100 нозологических форм, в числе которых болезни: 1) кожи и подкожной клетчатки (абцессы, панариции, фурункулез и др.), 2) органов дыхания (ангина, плеврит, пневмония и др.), 3) нервной системы и органов чувств (менингит, отит, коньюктивит и др.), 4) органов пищеварения (стоматит, перетонит, энтерит, энтероколит, пищевая интоксикация и др.), 5) костно-мышечной системы и соединительной ткани (артриты, остеомиелит), 6) кровообращения (эндокардит, флебит и др.), 7) мочеполовых органов (цистит, мастит и др.), 8) стафилококковый сепсис . Эти заболевания могут протекать остро или хронически. Пищевые отравления клинически проявляются в форме рвоты и водянистой диареи уже через 2-6 ч после употребления в пищу инфицированных продуктов - кондитерских изделий с кремом, консервов, мясных и овощных салатов и т.д.
Методы обнаружения
На селективных дифференциальных средах вырастают, как правило, только колонии стафилококков. Предположить стафилококковую этиологию заболевания позволяет выделение стафилококка в чистой культуре. Биоматериал для исследования выбирается в зависимости от клинической картины болезни. У штаммов S. aureus, выделенных при пищевой стафилококковой интоксикации, определяют наличие энтеротоксинов в биологических и иммунологических тестах. Традиционными методами предварительные результаты по идентификации стафилококковой инфекции можно получить через 1-2 суток.
Классический метод
Метод обнаружения S. aureus основан на высеве навески продукта и/или разведений его навески в жидкую селективную среду, инкубировании посевов, пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективно-диагностической среды, подтверждении по биохимическим признакам принадлежности выделенных типичных и/или атипичных колоний к S. aureus.
Микроскопия золотистого стафилококка . Выявление скоплений грамположительных кокков и полиморфно-нуклеар-ных лейкоцитов при исследовании окрашенных мазков клинического материала может служить основанием для предварительного диагноза. Следует помнить, что результаты микроскопии нельзя считать достаточными для выдачи окончательного заключения.
Посев золотистого стафилококка проводят на простые питательные среды, обычно на тио-гликолевую среду и КА. Если существует риск контаминации образца, применяют дифференциально-диагностические среды. Наиболее часто используют молочно-солевой (или молочно-жел-точно-солевой) агар и солевой агар с маннитом, на них рост контаминирующей микрофлоры угнетает высокая концентрация NaCl. Кроме того, на молочно-солевом агаре (МСА) хорошо проявляется способность к пигментообразованию и разложению лецитина (лецитовителазная активность). В последнее время широкое распространение в качестве дифференциально-диагностической среды нашёл агар с колистином и налидиксовой кислотой.
Через 18-24 ч золотистый стафилококк (S. aureus ) образует гладкие выпуклые мутные колонии диаметром около 4 мм. Бактерии синтезируют жёлтый пигмент, цвет колоний варьирует от белого до оранжевого. На КА колонии S. aureus окружены зоной полного гемолиза (рис. 1, см. цветную вклейку).
Стафилококки хорошо растут на бульоне, сначала вызывая его равномерное помутнение, а затем образуя рыхлый хлопьевидный осадок. Они дают весьма характерный рост в желатине; через 24-28 ч (наряду с обильным ростом по ходу укола микробиологической иглы) наблюдают начальное разжижение среды, а на 4-5-е сутки образуется открытая вниз воронка, заполненная разжиженной средой.
Для внутривидовой дифференцировки золотистого стафилококка (S. aureus ) применяют коагулазный тест (на наличие свёртывающего фактора), положительный у 95% изолятов (рис. 12-3). Существует ещё несколько дифференцирующих признаков.
Способность ферментировать маннит в анаэробных условиях.
Лецитовителазная активность - образование перламутрового преципитата-«венчика», окружающего колонии, выросшие на средах с добавлением яичного желтка. Преципитат состоит из фосфорилхолина, образующегося из лецитина яичного желтка под действием фермента.
Способность синтезировать термостабильную ДНКазу.
Способность агглютинировать сенсибилизированные эритроциты барана (последний тест позволяет выявить белок А, свёртывающий фактор либо оба продукта).
Для экспресс-идентификации золотистого стафилококка (S. aureus ) применяют тест латекс-агглютинации с использованием коммерческих наборов частиц латекса, нагруженных AT, например «Staphylatex» (American Microscan).
